[发明专利]一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用

说明书

一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用，属于生物工程技术领域。该工程菌的保藏编号为CGMCC No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。本发明主要公开嗜热碱性果胶裂解酶，最适反应温度为70℃，最适Ca²⁺浓度为0.8mM，底物为0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸，pH 9.5。该酶在最适pH 9.5、Ca²⁺0.8mM、70℃时酶比活为900U/mg；在70℃保温下，半衰期为6h；经过镍柱纯化处理后CbPelC可达到50mg/L(1L发酵液)。本发明所述嗜热碱性果胶裂解酶的耐热性和产量有大幅度挺高，更加适应现代工业生产要求，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及该酶在降解果胶物质中的应用。

背景技术

果胶物质主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)组成，并且侧链还常带有海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，广泛存在于植物初生细胞壁中。

果胶酶是一系列分解果胶物质的酶类的总称，在高等植物和微生物中分布甚广。植物在成熟过程中，果胶酶使植物细胞壁更松软，对植物组织腐败再生平衡也起到了重要作用。果胶酶按其作用方式的不同可分为两大类，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分为水解酶和裂解酶。水解酶是通过引入水分子水解糖苷键，而裂解酶是通过反式消去作用断裂糖苷键。

果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁并导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶，它在果胶降解过程中起着重要的作用。其作用机制是通过β-消旋的方式作用于断裂糖苷键，形成不饱和双键，产生不饱和的半乳糖醛酸寡聚糖。果胶裂解酶也是麻料脱胶工艺和纺织工艺中不可缺少的主要酶类。在医药、生物技术、饲料加工、环保方面也具有相当地位，在木材防腐和造纸等方面也应用广泛。

目前果胶裂解酶主要以碱性酶为主，而且大多是常温酶，嗜热酶较少，迄今为止，关于嗜热纤维素酶的报道很多，而关于嗜热果胶酶的报道很少。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种Caldicellulosiruptor bescii基因来源的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌以及构建方法，所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌Escherichia coliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC，其保藏编号为CGMCC No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期为2015年9月29日。

工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，进行分离纯化得到嗜热蛋白，即嗜热碱性果胶裂解酶。

本发明制备的嗜热碱性果胶裂解酶的产量可达到50mg/L(1L发酵液)，相对现有国内筛选到的碱性果胶酶，是一种效价很高的碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

本发明所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌以源于热梭杆菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的基因为模板，设计引物，通过PCR反应扩增3’端含有6个组氨酸标签的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，测序谱图如图1所示。将该嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC连接到表达载体pET20b(+)上获得重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。