[发明专利]ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法

说明书

本发明公开了ω‑转氨酶突变体及其编码基因和制备方法，ω‑转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。本发明还公开了包含所述基因的表达盒、重组质粒和转化子。本发明利用温度因子(B‑factor)结合能量优化策略对野生型ω‑转氨酶进行突变位点预测，进而进行定点突变，制得所述ω‑转氨酶突变体。本发明筛选得到的突变体热稳定性优于野生型转氨酶。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及ω-转氨酶突变体及其编码基因和制备方法。

背景技术

酶的稳定进化方法一直是蛋白质工程中极为重要的研究领域之一。近年来，计算机辅助的蛋白质稳定化设计取得突破式的进展。与传统随机突变进化方法相比，以能量计算为基础的计算辅助设计方法可以提高氨基酸突变的有效性，减少突变数目，降低筛选工作量，极大地提高设计成功率。对酶分子的热稳定性改造而言，目前已有多种设计方法应用于识别酶的不稳定区域，并已在一些酶的热稳定性改造中得到了成功应用。温度因子(B-factor)是晶体学中的一个重要参数，反映的是晶体中的各原子受热运动的影响程度，原子在热运动作用下的形变越大，温度因子值就越高。对蛋白质而言，如果某一氨基酸残基的B-factor值越高，则表明该氨基酸残基所在部位的结构就越不稳定。因此可以分析蛋白质结构中各个氨基酸残基的B-factor值，从而识别出需要改造的、不利于保持蛋白质稳定性的区域。

定点突变(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对的技术，通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构和功能的影响。在酶的理性设计中，研究者采用定点突变技术筛选得到热稳定、酶活力提高的突变酶。公告号为CN 102660515 B的专利文献公开了一种酶活性提高的谷氨酰胺转氨酶。该发明以谷氨酰胺转胺酶在大肠杆菌中的高效表达为改造平台，对MTG成熟酶N端氨基酸进行缺失和饱和突变，得到了酶学性质较好的突变株，比酶活提高1.85倍，热稳定性提高2.7倍。改造后的酶更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

转氨酶能催化氨基由氨基供体向氨基受体的转移反应，具有较高区域选择性和立体选择性。转氨酶既可以通过动力学拆分消旋胺，也能通过酮的不对称合成生成手性胺，比传统化学催化方法更具有吸引力和竞争力，已成为工业上用于生产氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要农药或医药中间体的常用酶之一。根据PFAM数据库中的多序列比对，转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶(ω-transaminase，简称ω-ATs)的底物结合口袋大于天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。来自于土曲霉(Aspergillus terreus)的ω-转氨酶能催化(R)-α-甲基苄胺生成苯乙酮，手性选择性为(R)型。实验表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其耐热性有待进一步提高。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了ω-转氨酶突变体，通过定点突变替换掉热稳定性差的氨基酸残基，获得比野生型转氨酶具有更好热稳定性的ω-转氨酶突变体，提高ω-转氨酶在工业上的应用价值。

ω-转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示。

第一种ω-转氨酶突变体的第130位氨基酸由苏氨酸突变为苯丙氨酸，该ω-转氨酶突变体(T130F)的半失活温度为40.9℃，比野生型酶提高2.9℃；ω-转氨酶突变体(T130F)在40℃下的半衰期为13.2min，比野生型酶延长6.3min。