[发明专利]一种鸭黄病毒核酸液相芯片的检测方法

权利要求书

1.鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）设计引物探针；

（2）RT-PCR反应体系的建立；

（3）液相芯片检测体系的建立；

设计的引物探针序列如下：

Primer1：DYF:5’-AGAATCCAGATGCCCAACCA-3’；

Primer2 ：DYR:5’-Biotin-CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC-3’；

Probe：DYProbe:5’-NH₂(CH₂)₁₂-TCATAATCCCAAGGCAAC-3’；

RC-Probe：DY-RCProbe:5’-Biotin-GTTGCCTTGGGATTATGA-3’；

所述的RT-PCR反应体系的建立包括下列步骤：

采用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；在0.2 mL PCR反应管中，依次加入10×RT-PCRbuffer， 2.5μL；各2.5 mmol/L 的dNTP ，2.0μL；10 pmol/μL 引物对， 各1μL；Inhibiter0.5μL；AMV XL 0.5μL；5 U/μL的AMV TaqμL，0.25μL；25 mmol/L MgCl₂， 5.0μL；RNA 模板5.0μL；加入双蒸水7.25μL；使反应体积达到25μL；

在PCR仪上进行RT-PCR扩增，优化并确定RT-PCR工作程序：50℃ 30min；94℃ 2min；然后94℃ 30sec、58℃ 30sec、72℃ 30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温；

扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物；

所述的液相芯片检测体系的建立，包括下列步骤：

（1）寡核苷酸探针与微球共价偶联

①将微球漩涡混合20s充分分散；取75μL 的3×10⁶个微球，于1.5ml离心管中10000g离心1min，去上清；

②加入50μL pH4.5的 0.1mol/L甲基咪唑溶液，漩涡混合，超声波处理0.5-1min；

③加入氨基化探针1.0nmol，漩涡混合；

④加入2.5μL碳二亚胺溶液充分混匀，室温避光孵育30min；碳二亚胺溶液的配置方法是10mg的碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水；

重复④一次；

加入1.0ml 0.02% Tween-20，混匀，10000g离心1min，弃上清；

加入1.0ml 0.1% SDS，混匀，10000g离心1min，弃上清；

用pH4.5的0.1mol/L甲基咪唑溶液100μL 重悬微球，2-8℃避光保存，待用；

（2）杂交

杂交体系包括1.5μL探针偶联微球，33μL 1.5×TMAC 杂交液，14.5μL TE，2.5μL RT-PCR产物；混合均匀后于98℃变性10min，孵育15min，18000g离心2min 去上清；加入50 μL用1×TMAC 杂交液稀释500倍的并经过PE标记的链亲合素，52下℃孵育10-15min，18000g离心2min 去上清；加入50 μL 1×TMAC 杂交液，漩涡混合使微球重悬，上机分析。