[发明专利]一种鸭黄病毒核酸液相芯片的检测方法

说明书

本发明公开了一种鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法，包括下列步骤：（1）设计引物探针（2）RT‑PCR反应体系的建立（3）液相芯片检测体系的建立。本发明的检测方法具有高通量、检测灵敏度高、重复性好等优点，结合RT‑PCR技术，通过稳定性试验、特异性试验与灵敏度试验，成功构建了液相芯片技术检测鸭病毒的检测平台。

技术领域

本发明涉及一种鸭黄病毒核酸液相芯片的检测方法。

背景技术

鸭黄病毒属于黄病毒科、黄病毒属、恩塔亚病毒群，和该群中的Tembusu病毒亲缘关系最近。该病毒引起的传染病于2010年5月在浙江、江苏、福建等地发生感染，主要引起蛋鸭和种鸭产蛋量骤减，甚至停产，发病率达100％，死亡率约5％～10％。目前，华北、华中、华南和西南等地均有该病发生的报道，流行区域几乎遍及我国主要水禽产区。据国家水禽产业技术体系2010年11月份调查显示，该病造成的经济损失已超过50亿元。

目前疫病病原检测主要以PCR和免疫学方法为主，但其不能满足出入境等高通量检疫的要求，且临床中多种疫病的病原鉴别诊断要求快速、高灵敏的检测技术。液相芯片技术是一种被用于临床诊断的新型生物芯片，由Luminex公司于1995年研发，该技术是一项突破性的生物芯片分子检测新技术，具有高通量、灵敏度高、重复性好、灵活性大的特点。液相芯片技术已通过FDA批准，应用于医学临床的高通量检测，它在各种应用中的检测结果与传统的ELISA基本一致，但有着ELISA无法比拟的优越性。本研究利用液相芯片技术建立检测鸭黄病毒核酸的方法,并评价了该检测方法的敏感性和特异性，为鸭黄病毒性动脉炎的的检测提供了一种高通量、敏感、特异、快速、高效的方法。

液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起的一种集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的新型生物分子高通量多重检测技术。它既可进行免疫学检测也可进行核酸检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的鸭黄病毒核酸液相芯片检测方法，包括下列步骤：

(1)设计引物探针

(2)RT-PCR反应体系的建立

(3)液相芯片检测体系的建立

所述的设计的引物探针序列如下：

Primer1：DYF:5’-AGAATCCAGATGCCCAACCA-3’；

Primer2：DYR:5’-Biotin-CACAATCCTGCCTTCTGCTTTC-3’；

Probe：DYProbe:5’-NH₂(CH₂)₁₂-TCATAATCCCAAGGCAAC-3’；

RC-Probe：DY-RCProbe:5’-Biotin-GTTGCCTTGGGATTATGA-3’。

所述的RT-PCR反应体系的建立包括下列步骤：

采用RNA提取试剂盒进行RNA的提取；在0.2mL PCR反应管中，依次加入10×RT-PCRbuffer，2.5μL；dNTP(各2.5mmol/L)，2.0μL；10pmol/μL引物对，各1μL；Inhibiter 0.5μL；AMV XL 0.5μL；AMV Taq(5U/μL)，0.25μL；25mmol/L MgCl₂，5.0μL；RNA模板5.0μL；加入双蒸水7.25μL；使反应体积达到25μL；