[发明专利]一种基于鸟嘌呤的超猝灭分子信标的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物及分析化学技术领域，具体涉及利用有机猝灭基团及鸟嘌呤的双 猝灭作用构建一种超猝灭分子信标传感器及其应用。

背景技术

分子信标(molecularbeacons)是一种呈发夹结构的茎-环双标记的寡核苷酸探 针。经典分子信标由Tyagi于1996年首次发明，由茎、环、有机荧光基团及有机猝灭基团四部 分构成。自1996年Tyagi首次将分子信标用于核酸检测以来，许多科研工作者在经典分子信 标的基础上合成了不同类别的分子信标。分子信标具有操作简单、选择性好以及不必与未 反应的探针分离即可实时检测等优点，现已广泛应用于聚合酶链反应(PCR)的实时监测，基 因突变的快速分析，核酸及蛋白质检测，细菌及病毒分析，酶降解监测以及核酸-蛋白质的 相互作用研究等方面。

尽管分子信标在各个领域中都获得了较为成功的应用，但现有的分子信标在对实 际样品的定量分析中，荧光背景与其结构之间存在着较为突出的矛盾。经典分子信标结构 简单、合成容易，但存在较高的荧光背景，而荧光背景的存在严重地影响其在定量分析中的 灵敏度及定量限。为了解决经典分子信标存在较高荧光背景的问题，许多科研工作者通过 改变经典分子信标中的猝灭基团来降低其荧光背景。例如Maxwell和Mao等用金纳米粒子作 为荧光猝灭剂替代经典分子信标中的猝灭基团，设计了新型分子信标。在该分子信标中，金 纳米粒子对荧光基团羧基荧光素(FAM)的平均猝灭效率达到98.68％；Yang等通过用多个猝 灭基团组装成一个猝灭分子阵列同时对一个荧光基团进行猝灭，构建了超猝灭分子信标。 他们用3个4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(DABCYL)分子组成的分子阵列对FAM的平均猝灭效率可 达99.5％；Lu等利用氧化石墨烯替代分子信标中的有机猝灭基团，显著降低了分子信标的 荧光背景，得到很高的信噪比。这些改进的分子信标虽然显著地降低了荧光背景，但是结构 复杂，而复杂的结构又带来了新的问题。一是有的分子信标制备过程非常复杂，制备时间 长；二是有的分子信标自身稳定性相对较差，检测结果的重复性不好；三是有的分子信标中 由于有较大粒径的纳米粒子的存在，空间位阻大，与目标物反应速度慢。

理论上讲，一个理想的分子信标应满足以下几个条件：(1)荧光背景低；(2)稳定性 好且结构简单，制备过程容易；(3)与目标物反应速度快。但目前所报道的分子信标都很难 同时满足以上条件。

鸟嘌呤(G碱基)对很多有机荧光染料具有很好的猝灭作用。其基本原理为G碱基在 荧光共振能量转移中可作为荧光能量受体，许多有机荧光染料的荧光可以通过光诱导电子 转移的方式被其猝灭。例如Torimura等利用核酸杂交实验研究了G碱基对有机荧光基团的 猝灭效果，结果表明G碱基对FAM的猝灭效率可达到86％，对羧基四甲基罗丹明(TAMRA)的猝 灭效率可达89％。本发明人利用G碱基对FAM及TAMRA的猝灭作用设计了一种复合分子信标， 结果表明G碱基对FAM的猝灭效率可达到82.3％，对TAMRA的猝灭效率可达81.6％。这充分说 明G碱基对FAM及TAMRA确实具有很好的猝灭效果。

针对现有分子信标在定量分析中存在的问题，结合G碱基对某些荧光基团的猝灭 作用，本发明人利用G碱基和有机猝灭基团对某些有机荧光基团的双重猝灭作用，发明了一 种结构简单、合成容易、稳定性好、与目标物反应速度快的超猝灭分子信标，并对所发明的 超猝灭分子信标进行了应用。

发明内容

本发明的目的就是针对现有分子信标的局限性，提供一种结构简单、合成容易、稳 定性好的超猝灭分子信标，并将其应用到核酸及病毒的检测中。

本发明的第一方面，在于提供了一种基于G碱基和有机猝灭基团的双重猝灭作用 所构建的超猝灭分子信标探针(图1)。超猝灭分子信标探针5’端标记能被G碱基和有机猝灭 基团进行双重猝灭的荧光基团，3’端标记猝灭基团；探针环的部分为13-45个碱基，能与靶 标分子发生特异性反应。探针在游离状态下形成茎-环的发卡结构，荧光基团与有机猝灭基 团和G碱基相互靠近，荧光基团的荧光被有机猝灭基团和G碱基猝灭，当探针与目标分子结 合时，茎-环结构被破坏，荧光基团远离有机猝灭基团和G碱基，荧光基团的荧光恢复。其检 测原理如图1所示。