[发明专利]一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用，属于发酵工程技术领域。本发明通过在光滑球拟酵母菌株中定位表达线粒体丙酮酸载体蛋白于细胞膜上，加强丙酮酸出细胞的速率和缓解丙酮酸对糖酵解途径关键酶的反馈抑制作用，进而提高丙酮酸的产量和生产强度，通过基因工程技术，将来源于酿酒酵母的MPC1和信号肽序列Shrew1p定位整合到pY26表达载体上，构建酵母重组表达质粒pY26‑Shrew1p‑MPC1，并将其电转进受体菌TgU‑中获得一株一株高产丙酮酸的工程菌株TgU^‑(pY26‑Shrew1p‑MPC1)，相对于对照菌株TgU^‑(pY26)，工程菌TgU^‑(pY26‑Shrew1p‑MPC1)的细胞干重、葡萄糖消耗速率、丙酮酸的产量和丙酮酸生产强度相对于对照菌(TgU^‑(pY26))分别提高了58.3％、68.1％、154.4％和152.6％。

技术领域

本发明涉及一种丙酮酸生产强度提高的重组菌及其应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(pyruvate)是生物代谢的中间产物，处于各代谢途径的中间环节，如：是糖酵解的终产物；通过脱氢脱羧反应转化为TCA循环的起始物质乙酰-CoA；在丙酮酸羧化酶作用下生成TCA循环的中间产物草酰乙酸；通过转氨基作用生成丙氨酸等，同时也是非常重要的酮酸之一。由于丙酮酸是多种物质的合成前体，目前社会对丙酮酸的需求量日益增加，其广泛的应用于日化，食品，医疗，农业等行业。

丙酮酸的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两大类。化学合成法主要有酒石酸法、乳酸乙酷空气氧化法、经基丙酮法、电化学合成法、乳酸催化氧化法。目前丙酮酸的生产正在以前的化工合成转向通过微生物发酵制备。微生物发酵法相对于化工合成有更多的优点，如原料的转化率高，污染小，成本低等优点。

目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。目前对高产丙酮酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶进行过表达和一些旁路途径进行敲出。

目前，微生物发酵法生产丙酮酸作为一种替代性的绿色环保方法成为了国内外研究的热门。而要通过微生物发酵获得高产丙酮酸，其中最关键是要有一株高产并且高生产强度的丙酮酸菌株。目前对高产丙酮酸菌株的改造主要集中在对代谢途径中的某些关键酶进行过表达和一些旁路途径进行敲出。对通过怎么去加强丙酮酸出细胞的研究，则鲜有文献报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过定位表达线粒体丙酮酸载体于细胞膜上，加强丙酮酸出细胞的速率而缓解丙酮酸对糖酵解途径中关键酶的抑制作用，从而提高丙酮酸发酵产量和发酵强度。

本发明的第一个目的是提供一种产丙酮酸重组菌，所述重组菌过表达线粒体丙酮酸载体蛋白MPC1基因，所述MPC1基因连接有序列为SEQ ID NO.1的信号肽。

在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是NCBI上Gene ID:852800的MPC1。

所述重组菌是以缺失了Ura基因的光滑球拟酵母T.glabrata CCTCC M202019为宿主，表达连接有信号肽的NCBI上Gene ID:852800的MPC1。

在本发明的一种实施方式中，所述MPC1基因是以酿酒酵母菌株N85基因组为模板扩增得到的。

所述过表达是以酵母表达质粒pY26(购自德而宝公司)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽和MPC1基因通过BamH I酶切位点连接。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以缺失了Ura基因的T.glabrataCCTCC M202019为宿主、pY26为载体表达连接有信号肽的NCBI上Gene ID:852800的MPC1。