[发明专利]一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法

权利要求书

1.一种猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个 核细胞；

（2）按照1×10⁸/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠， 过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；

（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133(+)Lin(-) CD45(-)极小胚胎样干细胞。

2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述 的分离出猪骨髓总单个核细胞，步骤包括：

（1）猪的麻醉

选取2-4月龄、体重(35±5kg)小型成体猪，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射后20分 钟，待猪处于适度麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上；

(2)骨髓穿刺

以髂后或髂前上棘为穿刺点，于该点周围10cm范围备皮，继之用1%碘伏消毒三次，穿无 菌手术衣、带无菌手套后进行骨髓穿刺，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先 抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防骨髓液凝固；

(3)去除脂肪及泡沫

将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4℃条件下1000rpm离心10分钟去除脂肪及 泡沫；

(4)红细胞裂解

按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，轻轻旋转离心管以充分混 匀，室温下孵育10分钟，4℃下500rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液；按照裂解液与骨髓液 2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4℃下500rpm离心10分钟，吸除上清 液；

4℃下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液；

(5)总单个核细胞的分离

用30mL含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4℃下500rpm离心10分钟，用 2ml含2%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，以细胞计数板计数备用。

3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述 的获得猪骨髓CD133（+）细胞群，步骤包括：

(1)加FcR非特异性吸附剂封闭细胞

将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500rpm离心10分钟，按照1×10⁸/300ul细胞浓 度加入缓冲液重悬细胞，按照1×10⁸/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；

(2)加CD133抗体免疫磁珠标记细胞

按照1×10⁸/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2℃～ 8℃孵育30分钟，按照1×10⁸/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500rpm离心10分钟， 小心吸除上清液后按照1×10⁸/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；

(3)细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞

将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸 取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流 尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱 内磁珠结合的细胞即为CD133（+）细胞。