[发明专利]一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域,特别是涉及极小胚胎样干 细胞分离与纯化领域。

背景技术

极小胚胎样干细胞(verysmallembryonic-likestemcells，VSELs)是一类体 积非常细小、数量极少（占骨髓单个核细胞的0.01%-0.04%）、具有多能性的非造血干细 胞。VSELs于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学MariuszRatajczak等人从小鼠骨髓单 个核细胞中成功分离并命名,细胞表型为Sca-1（+）lin（-）CD45（-），直径2-4μm。该团队进一 步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在，细胞表型为 SSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为4-6μm。人和鼠VSELs的生物学特性 主要包括：较血小板大，红细胞小，细胞核大，含常染色质，表达原始多能干细胞标志Oct-4 和Nanog，具有多分化潜能特性，与胚胎干细胞(ESCs)或诱导的胚胎样干细胞(iPSs)有相似 之处,即能在体内分化为所有三种胚系的细胞如血细胞、骨细胞、肌细胞和神经细胞等。该 细胞与衰老有关，随着年龄的增长其含量会进一步的降低，并且在体外单独培养的情况下 很难扩增。由于VSELs可以向三个胚层分化，且无免疫排异、无伦理问题，被认为具有替代胚 胎干细胞的潜力，其在科学界深受重视。已表明在心肌梗塞的鼠动物模型以及心肌梗塞和 中风患者中循环水平大大增加，也显示出VSELs在体内修复损伤心肌、骨骼、胰岛、神经组织 和免疫系统的有效性。尽管有人推测VSELs有可能改变再生医学，但鉴于VSELs是体内非常 稀少的成体多能干细胞，分离、培养技术复杂，而且正如加州斯坦福大学Weissman、波兰亚 捷隆大学的Dulak等教授按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析，却无 法从鼠的骨髓、人的脐带血中分离到极小的胚胎样干细胞，或者在直径小于7微米的老鼠骨 髓细胞中，未能发现与多能性有关的分子标签，纷纷质疑其存在和价值，因此，如何改进分 离与纯化技术是VSELs研究中急需解决的问题。

因VSELs体积小、数量少和贴壁能力弱，通常的骨髓非造血干细胞分离方法即贴壁 分离法和密度梯度离心法所获取的细胞得率相当低，故不适合VSELs的分离。红细胞裂解 法、流式细胞分选法或免疫磁珠分选法虽可以用于人和鼠VSELs的分离，但单独一种方法均 不能达到满意效果，单纯采用免疫磁珠法，细胞繁杂，纯度不够；单纯采用流式分选尤其是 处理大量细胞样品需达到一定数量的目标细胞，一次须24-36小时，易损伤和污染细胞。另 外，迄今为止，尚缺乏大型偶蹄动物VSELs的分离或纯化报道。

发明内容

针对目前极小胚胎样干细胞制备难度大、周期长、效率低、纯度不高，且上述任何 一种方法均不能达到满意的效果，本发明提供了一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方 法，包括以下步骤：

（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RMPI1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个 核细胞；

（2）按照1×10⁸/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁 珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；

（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133(+)Lin(-) CD45(-)极小胚胎样干细胞。

本发明将红细胞裂解法、免疫磁珠分选法（MACS）和流式细胞分选术（FACS）三道程 序科学组合，50ml猪骨髓液分离时间缩短至4-6小时，纯度达到95%以上、细胞得率高、细胞 数量达到1×10⁵以上。与采用红细胞裂解法和经典流式细胞分选（公开号103396988A）相比 效率提高3-4倍，单纯采用流式分选如达到一定数量级的目标细胞，每次须24-36小时、耗时 长，细胞大量损伤且少量VSELs有可能已分化为较成熟细胞；与采用某一种单抗磁珠分选法 （公开号102229910A）相比纯度显著增高。发明提出的高效VSELs的分离、方法具有巨大的应 用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。