[发明专利]三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法

权利要求书

1.三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，其特征在于：包括DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列。

2.权利要求1所述基因序列在使用分子鉴定方法鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠中的应用。

3.根据权利要求2所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)DNA模板的制备按照DNeasyBlood&Tissue试剂盒使用说明书提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；或者采用酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；

(2)PCR扩增PCR反应扩增体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP2μL，25μmol/L的DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，模板DNA2μL，ddH₂O16.3μL；

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后再72℃延伸10min；

(3)PCR产物检测取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，120V电压，电泳30min，溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，取电泳效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序；

(4)序列分析将步骤(3)测得的序列与DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列和DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列，进行对比分析，判断待测标本的种属情况。

4.根据权利要求3所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：所述酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA的具体过程为：液氮速冻肝脏、肌肉、皮毛或骨骼样本并研磨，转移至10mL的离心管，加入DNA提取液，混匀，冰上放置；加入等体积的酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，涡旋5min；8000rpm，4℃，5min离心，取上清液，再加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1抽提；重复加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1抽提，取上清液至新离心管中；加入所取上清液2.5倍体积无水乙醇，轻柔混匀，-20℃沉淀30min；10000rpm，4℃，离心10min收集沉淀；75％乙醇漂洗沉淀，空气干燥后，用ddH₂O溶解沉淀，即得模板DNA。

5.根据权利要求4所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：所述DNA提取液包括Tris-HCl400mMpH8.0；NaCl150mM；EDTA60mM；SodiumDodecylSulfate10g/L。

6.根据权利要求3所述鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法，其特征在于：步骤(3)所述测序所用引物为DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物。