[发明专利]三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA条形码领域，具体是三峡库区沿江口岸4种主要鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法。

背景技术

Hebert等在2003年明确提出DNA条形码的概念，DNA条形码就是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的方法。COI，cytB，16sRNA等基因均可以被选做条形码。

相较于传统形态学方式，DNA条形码拥有如下优势：①分子鉴定技术可以鉴定鼠体不完整的标本，理论上只需要提取足够PCR扩增反应的组织就可以鉴定种群；②技术简便，简捷快速，易于构建统一的DNA条形编码数据库。可以实现门、纲、目、科、属、种、亚种等不同分类水平物种的鉴定，且具有高度的可重复性；③DNA条形码技术不需要像形态学鉴定那样需要较多经验积累。传统的形态学鉴定依靠外形、头骨、牙齿等特征，十分依赖和模式标本的对比，专业性强。

目前文献显示，国内鼠类分子鉴定多选用COI基因作为条形码序列，通过保守通用引物从目标鼠DNA扩增获得COI基因，测序后对序列进行检索，比对，能成功地鉴定目标种类的种属情况。但是COI基因相对较保守，对于亚种，地理种等鉴定效果不佳，且进化速度较慢，不能对种内不同地理种，不同个体进行区别。

三峡库区是三峡工程建设后形成的特殊区域，生态环境及鼠类种群分布存在其特殊性。库区口岸主要鼠类有黄胸鼠，褐家鼠，小家鼠和黑线姬鼠等。随着库区口岸开放程度，截获入境鼠类数量越来越多。目前，鼠类鉴定仍以形态学鉴定为主，但不同区域的同一种鼠类存在遗传差异，明确其分子鉴定标签基因特征对鼠类快速鉴定十分必要，同时可弥补传统形态学鉴定的不足。了解本地主要鼠类分子鉴定特征十分重要。

发明内容

鉴于以上缺陷，本发明的第一目的是提供三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，第二目的是利用上述4种鼠类cytB特异序列鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠的分子鉴定方法。

为了实现上述第一目的本发明采用的技术方案是：三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列，包括DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列；DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列。

为了实现上述第二目的本发明采用的技术方案是：上述4中基因序列在使用分子鉴定方法鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠中的应用，包括以下步骤：

(1)DNA模板的制备按照DNeasyBlood&Tissue试剂盒使用说明书提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；或者采用酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA；

(2)PCR扩增PCR反应扩增体积为25μL，其中10×缓冲液2.5μL，10mmol/LdNTP2μL，25μmol/L的DNA序列为SEQIDNO.5的正向引物和DNA序列为SEQIDNO.6的反向引物各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，模板DNA2μL，ddH₂O16.3μL；

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后再72℃延伸10min；

(3)PCR产物检测取5μLPCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳(120V电压，电泳30min)，溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，取电泳效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序；

(4)序列分析将步骤(3)测得的序列与DNA序列为SEQIDNO.1的黄胸鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.2的小家鼠cytB基因序列，DNA序列为SEQIDNO.3的褐家鼠cytB基因序列和DNA序列为SEQIDNO.4的黑线姬鼠cytB基因序列，进行对比分析，判断待测标本的种属情况。

本实发明具有以下有益技术效果：本发明获得三峡库区主要鼠类cytB特征序列，为入境截获鼠类种群分子鉴定提供了数据参考，能快速进行遗传分析以确定截获鼠类是否为本地鼠类。还能对种内不同地理种，不同个体进行区别。