[发明专利]一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术

权利要求书

1.一种基于小鼠睾丸内注射的基因定点编辑技术，其特征包括如下步骤：

一、睾丸注射液的制备

1、载体的构建与检测根据目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，根据设计出的sgRNA序列合成一对序列互补的双链寡核苷酸序列；将双链寡核苷酸序列与线性化的CRISPR/Cas9质粒连接，转化提取带有特异性靶向目的基因的sgRNA的表达载体（根据需要，载体可以加入合适的表达标签）；

2、睾丸注射液

（1）注射转染A液：无菌、无血清的DMEM培养液与脂质体Lipofectamine?2000按照9：1的比例进行混合；

（2）注射转染B液：无菌、无血清的DMEM培养液与CRISPR/Cas9表达质粒混合，每mlDMEM培养液中加入45μg表达质粒；

（3）注射转染C液：1%台盼蓝溶液；

（4）将等体积的注射转染A液和B液混合，室温下作用30分钟后，继续加入注射转染C液，体积为注射转染A液的1/10，即获得睾丸注射液；

二、动物的选择和管理

成年雄性动物，睾丸发育正常；

在睾丸注射前保定动物，全身麻醉；

三、睾丸内注射

用手术刀于阴囊开一小口，将单侧睾丸通过开口裸露于体外，用微量注射器吸取相应剂量的试剂，穿过睾丸白膜刺入睾丸实质5-6mm，将睾丸注射液缓缓注射入睾丸；

可睾丸内多点注射，也可进行曲细精管显微注射；

对另一侧睾丸进行相同操作；

第一次注射后，隔24小时再重复操作一次；

四、注射效果的检测与动物的应用

第二次注射5天后，采集小鼠精液，提取精子DNA，设计引物，进行PCR和SouthernBlotting实验，检测注射效果和外源基因编辑效果；

阳性小鼠通过自然交配、人工授精、胞浆内注射等多种途径使外源目的基因进入胚胎，大量、高效的获得转基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的制备转基因动物的技术，包括睾丸内注射与基因定点编辑技术相结合。

3.根据权利要求1所述的制备转基因动物的技术，优化的小鼠睾丸内多点注射方法。