[发明专利]一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过小鼠睾丸注射进行基因定点编辑的技术，属于动物遗传育种领域。

背景技术

转基因动物是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，且外源基因能稳定遗传给后代的遗传工程动物。由于转基因动物在发育生物学和遗传学基础研究、培育动物新品种、大规模生产药用蛋白一直生产再植器官等方面有着广泛的应用前景，成为当前研究的热点。

精子具有主动结合、转运、整合外源DNA的能力，并在受精时导入卵母细胞，获得转基因动物。精子介导基因转移（Sperm-mediatedgenetransfer,SMGT）是目前获得转基因动物简单而高效的方法之一。睾丸注射法作为SMGT方法的一种，其是将外源目的基因直接注入动物睾丸内，和精原干细胞（SSCs）染色体进行整合，获得基因得到修饰或编辑的精子，然后通过自然交配、人工授精、胞浆内注射等多种途径使外源目的基因进入胚胎，获得转基因动物。此法避免了传统的精子介导基因转移方法的精子与外源DNA共孵育时精浆的抑制作用，无需复杂的体外处理过程，而且耗费小，操作简便，是近年来颇受关注的一种方法。

基因编辑技术是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可以完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段缺失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列系统（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，associatedRNAguidedendonucleaseCas，CRISPR/Cas9）是第三代人工核酸内切酶技术，与锌指核酸内切酶（ZincFingerNucleases，ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TranscriptionActivator-likeEffectorNucleases，TALENs）一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞治疗遗传缺陷疾病，由于其突变效率高，制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因定点改造分子工具。

目前基因编辑技术主要是把人为设计的质粒载体通过显微注射的方法注入胚胎，有繁琐的体外细胞操作过程，对昂贵精密仪器设备也有严格要求。本发明克服了细胞培养的技术难题和成本高昂的难题，充分利用了CRISPR/Cas9基因编辑系统的优势，结合现有的转基因动物技术，大幅度提高基因修饰动物的获得的效率。

发明内容

本发明方法重点是优化了小鼠睾丸注射法，将CRISPR/Cas9构建的载体通过睾丸内多点注射或曲细精管显微注射，使之与精子染色体进行整合，实现基因的删除、替换、插入等目的。主要包括以下步骤：

一、睾丸注射液的制备

1、载体的构建与检测根据目的基因序列设计用于特异性靶向目的基因的sgRNA，根据设计出的sgRNA序列合成一对序列互补的双链寡核苷酸序列；将双链寡核苷酸序列与线性化的CRISPR/Cas9质粒连接，转化提取带有特异性靶向目的基因的sgRNA的表达载体（根据需要，载体可以加入合适的表达标签）。

2、睾丸注射液

（1）注射转染A液：无菌、无血清的DMEM培养液与脂质体Lipofectamine?2000按照9：1的比例进行混合；

（2）注射转染B液：无菌、无血清的DMEM培养液与CRISPR/Cas9表达质粒混合，每mlDMEM培养液中加入45μg表达质粒；

（3）注射转染C液：1%台盼蓝溶液；

（4）将等体积的注射转染A液和B液混合，室温下作用30分钟后，继续加入注射转染C液，体积为注射转染A液的1/10，即获得睾丸注射液。

二、动物的选择和管理

成年雄性动物，睾丸发育正常。在睾丸注射前保定动物，全身麻醉。

三、睾丸内注射

用手术刀于阴囊开一小口，将单侧睾丸通过开口裸露于体外，用微量注射器吸取相应剂量的试剂，穿过睾丸白膜刺入睾丸实质5-6mm，将睾丸注射液缓缓注射入睾丸。

可睾丸内多点注射，也可进行曲细精管显微注射。对另一侧睾丸进行相同操作。

第一次注射后，隔24小时再重复操作一次。

四、注射效果的检测与动物的应用

第二次注射5天后，采集小鼠精液，提取精子DNA，设计引物，进行PCR和SouthernBlotting实验，检测注射效果和外源基因编辑效果。阳性小鼠通过自然交配、人工授精、胞浆内注射等多种途径使外源目的基因进入胚胎，大量、高效的获得转基因小鼠。

具体实施方式