[发明专利]一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其特征在于：主要由一步法微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其中一步法微滴数字PCR检测试剂包括以下试剂：

溶液A：RNaseFreedH₂O，一支，1mL；溶液B：一步法ddPCR探针法预混液，一支，900μL；溶液C：探针法ddPCR微滴发生油，一支，7mL；溶液D：ddPCR探针法质控液，3.5mL；溶液E：阳性对照，一支，40μL；溶液F：阴性对照，一支，40μL；使用基因组RNA为阳性模板，使用0.01MpH8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释后冷冻保存；阳性对照制剂按400μL定量分装；使用RNaseFreedH₂O为阴性对照；

其中所述的溶液B：一步法ddPCR探针法预混液900μL的组成为：500μL的2XOne-stepRT-ddPCRSupermixforprobes，上、下游引物分别为90μL，特异探针为30μL，引物和探针的浓度均为10μM；RNaseFreedH₂O190μL；

所述上、下游引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；特异探针的序列如SEQIDNO:3所示。

2.一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其特征在于：采用权利要求1所述的试剂盒进行微滴数字PCR定量检测。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：包括步骤：

(1)制备ddPCR反应液，总体积20μL，向扩增管中加入下列反应物：一步法ddPCR探针法预混液：18μL；RNA模板：2μL；

空白对照：以RNaseFreedH₂O代替模板，同样条件下扩增；

(2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20μL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内，不足8个样品时用20μL1×溶液D补足；

(3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔；盖上胶垫密封；

(4)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；

(5)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，缓慢吸取40μL，再打入96孔板相应位置孔内；

(6)封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应，升降温速度≤2.5℃/s；

(7)将完成PCR的96孔板放入plateholder中组装好，之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中；

(8)打开QuantaSoft软件进行检测分析。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中使用8通道20μL排枪和20μL枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。

所述步骤(5)中使用8通道100μL排枪和100μL枪头，加样时枪头接近微滴发生卡底部，缓慢吸出液体，转移至96孔板时，不贴壁，缓慢打入孔内，避免破坏生成的微滴。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中的PCR反应条件为：

反转录：温度50℃，10min，1个循环；

预变性：温度95℃，10min，1个循环；

变性：温度94℃，30s，退火：温度58℃，60s，共40个循环；

结束反应：温度98℃，10min，1个循环。

6.权利要求1所述的试剂盒在动物口蹄疫疾病早期诊断和防疫中的应用。

7.权利要求2-5任一项所述的检测方法在动物口蹄疫疾病早期诊断和防疫中的应用。