[发明专利]一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的一种感染偶蹄目动物的急性、热性、接触传染性动物疫病，感染患畜出现高热、特征性水泡，幼畜出现出血性胃肠炎和心肌炎。FMDV属于小RNA病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT37个血清型，血清型间无交叉免疫现象。我国主要流行O型和A型，Asia1型自2009年后未见临床病例报道。

世界动物卫生组织(OfficeInternationaldesEpizooties，OIE)将口蹄疫列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。2012年，国务院办公厅引发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》，将口蹄疫列为优先防治病种之一。口蹄疫自1514年在意大利首次出现，之后在世界各地都时有暴发。2002年在英国大面积暴发性流行，致使约400万动物因患病被屠杀，经济损失达300亿欧元，之后其被认定为是一种世界范围内的破坏性传染病。2015年5月至2014年底，我国共计向OIE报告115次口蹄疫疫情。其中Asia1型疫情46次，A型疫情31次，O型疫情38次。我国目前口蹄疫表现为毒株复杂、疫情复杂、在部分地区呈流行态势，仍然存在免疫带毒和免疫临床发病现象，但总体流行平稳。

口蹄疫病毒致死率很低，但病毒可以在体内长期存活，患畜持续排毒，成为重要的传染源，使其成为动物及家畜产品国际贸易最大的障碍。临床出现典型FMD症状时可做出疑似诊断。FMD与类似症状的疫病，如水疱性口炎(Vesicularstomatitis，VS)、猪水疱病(Swinevesiculardisease，SVD)、猪水疱疹(Vesicularexanthemaofswine，SVE)等，不易直接从临床症状确诊。因此，口蹄疫可疑病料必须借助实验室检测才能进行确诊。

传统的FMDV实验室检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、病毒中和试验(VNT)、补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、琼脂免疫扩散试验(AGID)和液相阻断酶联免疫吸附试验(液相阻断ELISA)等。随着分子生物学技术的不断发展，在临床上越来越多的通过分子生物学方法进行FMDV的检测。目前最常用核酸检测方法主要有反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)、实时荧光RT-PCR试验(RealtimeRT-PCR)和反转录环介导等温扩增试验(RT-LAMP)等。

早期诊断和疫苗的有效使用对于FMD的防控具有非常重要的意义。FMD的早期诊断需要快速、准确的FMDV检测方法，而FMD疫苗的研发和评价需要能够对FMDV准确的定量检测。因此，建立对FMDV快速、精确定量检测的方法，将为口蹄疫疫苗的研发、口蹄疫的快速有效控制提供坚实的技术支撑。

传统的FMDV检测方法，如病毒分离鉴定、病毒中和试验(VNT)、补体结合试验(CFT)、琼脂免疫扩散试验(AGID)和液相阻断酶联免疫吸附试验(液相阻断ELISA)等，存在需要时间长、依赖于经验丰富的检测人员、试验操作复杂、涉及活病毒操作、对检测环境要求较高，以及敏感性较低和重复性较差等诸多不足。RT-PCR、RealtimeRT-PCR和RT-LAMP等核酸检测方法，虽然较之传统方法具有特异性更强、灵敏度更高、自动化程度更高和结果重复性更好等优势，但是仅能实现FMDV的定性和半定量检测，无法对FMDV核酸进行精确的绝对定量检测，从而检测结果无法反映样品中病毒感染的真实情况。同时RT-PCR、Real-timeRT-PCR和RT-LAMP方法在灵敏度和特异性上仍存在一定的局限性，对于病毒核酸提取过程中的某些化学物质较为敏感，进而抑制PCR反应，出现“假阴性”结果。

发明内容

本发明解决的技术问题就是，提供一种具有灵敏度高、特异性强、高准确度和精确度，可实现精确定量的数字PCR检测方法和数字PCR检测试剂盒，用于口蹄疫病毒的快速精确检测。

本发明首先提供一种口蹄疫病毒微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，主要由一步法微滴数字PCR检测试剂和若干个微滴发生卡组装而成，其中一步法微滴数字PCR检测试剂包括以下试剂：