[发明专利]柠檬黄ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种用酶联免疫吸附法测定柠檬黄的方法，其特征是，在酶标板的微孔中加入抗柠 檬黄特异性单克隆抗体之前，在空白酶标板的微孔中先加入蛋白G。

2.权利要求1所述的方法，所述加入蛋白G，是将蛋白G用包被缓冲液稀释至0.1～ 1μl/ml，每个酶标板微孔加100μl，37℃孵育2h。

3.权利要求2所述的方法，所述包被缓冲液是0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液。

4.权利要求2所述的方法，步骤如下：

1)制备包被有蛋白G的酶标板

第一步：包被蛋白G

用包被缓冲液将蛋白G稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到空白酶标板的微孔内， 37℃孵育2h；

第二步：洗板

取出酶标板甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；

第三步：包被抗体

用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗柠檬黄特异性单克隆抗体稀释到10～100μg/ml，按 100μl/孔加到酶标板的孔内，37℃孵育0.5h；

第四步：洗板

取出酶标板，甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；

第五步，封闭

用1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；

第六步，干燥

取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；得到包被蛋白G的酶标板；

2)反应

操作步骤如下：在步骤1)制备的酶标板的各微孔中，或加入50μl系列浓度的柠檬黄 标准品，或加入50μl待测样品提取液；之后，每孔中再加入50μl酶标记柠檬黄抗原，此时 每微孔内含100μl溶液，25℃放置15min～60min；

3)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，洗涤酶标板孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩 掉板内液体并拍干板孔；

4)加底物：加入底物显色液放置10～20min，底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢 脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；

5)终止：加入2mol/LH₂SO₄，50μl/孔；

6)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。

5.权利要求4所述的方法，所述洗涤酶标板孔，是用PBST洗涤液洗涤酶标板孔，使 用洗涤液200～400μl/孔；

所述PBST洗涤液的配制：分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58g KH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，加0.5ml 吐温-20，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。

6.权利要求4所述的方法，所述系列浓度的柠檬黄标准品，浓度为0～4.05ng/ml，用 0.01mol/LPBS缓冲液配制；

所述PBS缓冲液的配制:分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na₂HPO4·12H₂O3.58gKH₂PO4 0.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，用双蒸水定容至1L 容量瓶中，4℃低温保存；

所述酶标记柠檬黄抗原的浓度是1:5000～25000。

7.一种检测柠檬黄的ELISA试剂盒，包括有柠檬黄ELISA检测试剂和酶标板，其特 征是，还含有蛋白G。

8.权利要求7所述的试剂盒，所述柠檬黄ELISA检测试剂包括柠檬黄标准品、经辣 根过氧化物酶标记的柠檬黄、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液。

9.权利要求8所述的试剂盒，所述样本稀释液为pH为7.4的10mMPBS缓冲液；洗 涤液为含0.2％Tween20pH为7.4的0.6MPBS溶液；终止液为含2mol/LH₂SO₄。