[发明专利]柠檬黄ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测色素柠檬黄的方法，本发明还涉及一种包被蛋白G的柠檬黄 的ELISA检测试剂盒。

背景技术

柠檬黄是应用最广泛的一种人工合成色素，用于食品、药品、化妆品、医疗器具、烟 草、饲料、食用包装、玩具等，常需要对上述产品中的柠檬黄进行定量检测，因为如果人 体摄入量柠檬黄过大，会产生伤害。

目前，国家标准规定的柠檬黄检测方法是高效液相色谱法、薄层分析法及分光光度计 法等理化方法，虽然结果准确，但由于其操作复杂、所需时间较长、检测成本较高的缺点， 不能适用于大规模操作。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有高效、灵敏、便于基层推广等优点，而且可以直 接采样进行检测，与HPLC、GC-MS检测有较高的一致性，目前已有应用于柠檬黄快速检 测的报道，但现有技术的柠檬黄ELISA快速检测方法具有以下缺点：

一是抗体利用率低。现有技术方法是抗体直接与酶标板反应，由于抗体排列不规则， 不能够保证与抗原有效相结合(见图1)。而且因为抗体利用率低，用量大，还需要较高纯 度，造成检测成本较高；

二是，由于与酶标板反应的抗体随机排列，导致排列不规则，使同一酶标板内和不同 酶标板间的各孔间变异大，影响检测结果的准确性。如图1所示。

另外，现有ELISA检测方法是先包被抗原，然后加抗体，再加酶标二抗，然后再加 显色剂。步骤较多，操作比较繁琐。

因此，如果能使得抗体Y排列较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合，将能有效 利用抗体。既提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种提高抗体利用率，降低检测成本，又 能提高检测结果准确性的检测柠檬黄的方法和试剂盒。具体目的是提供一种使抗体Y排列 较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合的ELISA检测方法。

本发明利用了蛋白G的功能。检测时，在酶标孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗体上 Fc部分特异结合的特点，所以将蛋白G偶联到酶标板上后，使抗体的Fab端朝向外侧，从 而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组 蛋白G与柠檬黄抗体IgG的结合能力，能够保证Y有效的跟抗原相结合，提高抗体的利用 率(见图2)。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂 盒柠檬黄抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。

不仅如此，对酶标板先经蛋白G处理再进行抗体包被，还可提高同一酶标板内或不同 酶标板中各孔间的均一性，提高检测的准确性。

所述蛋白G(ProteinG)是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，从链球菌A、C和G群 很多菌株的细胞壁及培养上清中提取得到。蛋白G能特异性的与多种动物抗体的Fc部位 相结合，并且具有很高的亲和力。

在实际应用中，所用的蛋白G也可以选用基因重组蛋白G，通过克隆蛋白G的基因序 列，在大肠杆菌中表达出与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G而获得。蛋白G可以通过市 售方式，方便获得。

本发明的实施例1分别采用本专利的方法和传统方法制备了用于柠檬黄检测的ELISA 试剂盒，实施例2、3比较了传统的方法和采用本专利的方法检测柠檬黄，由试验结果可以 看出可以只用原来的抗体浓度的十分之一，即可达到传统方法的检测效果；

实施例1是采用和未采用蛋白G处理的试验比较，其中：

实验1采用蛋白G处理，抗体用量为100微升，抗体浓度为1：1000000；

实验2未采用蛋白G处理，抗体浓度稀释比为1：100000，为实验1的10倍。抗体用 量未变，仍为100微升，

从结果可看出：采用蛋白G处理后，不仅节约了90％的抗体用量，而且每个批次的结 果更加均匀，结果更一致。

传统ELISA检测方法的步骤为：空白酶标板——包被抗体——加入标准物质或样品与 酶标化合物竞争反应；

本专利的步骤为：空白酶标板——包被一层proteinG——包被抗体——加入标准物质 或样品与酶标化合物竞争反应；

本发明与传统方法相比，最大的特点就是：通过这一技术处理，可以节省抗体用量， 减小板间板内的差异；同时通过优化抗体浓度以及酶标化合物可增加检测的灵敏度。

本发明建立的EL1SA检测方法的具体步骤如下：