[发明专利]一种番茄Mi-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种番茄Mi-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：

1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；

2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Mi-1和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；

3) 在上述扩增产物中加入TaqI酶和Buffer进行PCR产物酶切及电泳检测；

4)对待测番茄样品中是否含有Mi-1基因和ty-5基因进行鉴定，具体方法为，在酶切后的多态性条带中找出260bp和 206bp条带，即分别对应Mi-1基因和ty-5基因；

步骤2)中，ty-5引物为：

NACI-newF:TTGGATCTGTTCCGCCATG

NACI-newR:TTCCTGCTGCTCGGTTCG；

Mi-1引物为：

REX-1-newF:TCGGAGCCTTGGTCTGAATT

REX-1-newR:GCCAGAGATGATTCGTGAGA。

2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。

3.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，多重PCR反应体系为：

10ng/μl模板DNA2μL，

4pmmol/LNACI-newR/F各0.8μL，

4pmmol/LREX-1-newR/F各0.5μL，

mix酶10μL，

双蒸水或三蒸水加至20μL；

多重PCR反应条件为：94℃预变性3min；每个循环94℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)电泳采用2％的琼脂糖胶，电泳的具体步骤如下：

a)制备2％琼脂糖凝胶：称取琼脂糖置于锥形瓶中，加入1×TAE，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，冷却到65℃，加入核酸染色剂；

b)胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子；将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子将琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层；室温下静置直至凝胶完全凝固；垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中；添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止；

c)加样：分别将2μL样品加入胶板的样品小槽内；

d)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，电泳45min；

e)观察照相：采用凝胶成像系统观察并拍照保存。