[发明专利]一种重组人尿激酶原的纯化方法

权利要求书

1.一种重组人尿激酶原的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1）蛋白捕获：尿激酶原发酵液选用阳离子交换层析法得到中间体1；

步骤（2）凝胶层析：中间体1通过凝胶层析法获得中间体2；

步骤（3）阳离子交换层析：中间体2通过阳离子交换层析法获得中间体3；

步骤（4）亲和层析：中间体3通过亲和层析法获得中间体4；

步骤（5）阴离子交换层析：中间体4通过阴离子交换层析法获得中间体5；

步骤（6）阳离子交换层析：中间体5通过阳离子交换层析法获得尿激酶原原液；

其中，所述步骤（1）蛋白捕获，方法如下：发酵液过滤，取上清液调节pH值至5.5～6.5后阳离子交换层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为中间体1；

其中，步骤（2）以凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析，凝胶分子筛填料为SephacrylS-200 HR或Sephadex G-50，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl进行平衡，将中间体1直接上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为中间体2；

其中，步骤（3）以阳离子填料为介质进行交换层析，阳离子填料为SP Sepharose F.F.或SP Sephadex C-50 ，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5 含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，将中间体2调节pH值至6.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐缓冲液pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl洗脱杂质，0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐缓冲液pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl洗脱目标蛋白，根据UV280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为中间体3；

其中，所述步骤（4）亲和层析，方法如下：中间体3调节pH值至7.0±0.5后亲和层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为中间体4；

其中，所述步骤（5）阴离子交换层析，方法如下：中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0±0.5）按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后阴离子交换柱上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为中间体5；

其中，所述步骤（6）阳离子交换层析，方法如下：中间体5调节pH 值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即得尿激酶原原液，

其中，步骤（5）中Tris-HCl缓冲液，为pH8.0±0.5，含0～0.20mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，

其中，步骤（1）～（6）中所述层析，其中先用缓冲液平衡层析柱后再用缓冲液洗脱层析柱。

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤（1）、（3）、（6）所述的平衡层析柱的磷酸盐缓冲液含NaCl的浓度低于洗脱时磷酸盐缓冲液含NaCl的浓度。

3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，

其中，步骤（1）以阳离子填料为介质进行交换层析，阳离子填料为Streamline SP或SPSepharose F.F.，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至5.5～6.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/LNaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为中间体1；

其中，步骤（2）以凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析，凝胶分子筛填料为SephacrylS-200 HR或Sephadex G-50，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl进行平衡，将中间体1直接上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为中间体2；

其中，步骤（3）以阳离子填料为介质进行交换层析，阳离子填料为SP Sepharose F.F.或SP Sephadex C-50 ，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5 含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，将中间体2调节pH值至6.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐缓冲液pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl洗脱杂质，0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐缓冲液pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl洗脱目标蛋白，根据UV280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为中间体3；

其中，步骤（4）以亲和填料为介质进行亲和层析，亲和层析柱填料为BenzamidineSepharose 4FF H-sub或Arginine Sepharose 4B，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液,pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl进行平衡，中间体3溶液调节pH值至7.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为中间体4；

其中，步骤（5）以阴离子填料为介质进行交换层析，阴离子填料为Streamline DEAE或DEAE Sephacel DE-52，层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液，pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl进行平衡，中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0±0.5按1：2体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl洗脱缓冲液pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为中间体5；

其中，步骤（6）以阳离子填料为介质进行交换层析，阳离子填料为SP Sepharose F.F.或SP Sephadex C-50，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5 含0.05～0.15mol/L NaCl进行平衡，中间体5调节pH值至6.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl洗脱，根据UV280紫外吸收曲线收集目标蛋白。