[发明专利]一种重组人尿激酶原的纯化方法

说明书

本发明提供一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括蛋白捕获、凝胶层析、阳离子交换层析、亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析：该方法通过增加纯化步骤，优化纯化条件，使蛋白纯度提高至98％以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种重组人尿激酶原的纯化方法。

背景技术

尿激酶原(Prourokinase,简称pro-UK)是一类丝氨酸蛋白酶,可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶,从而溶解血栓中的纤维蛋白,因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。pro-UK中Lys158-Ile159间肽键容易被纤溶酶及其他一些酶类水解,生成尿激酶(urokinase,简称UK)。UK由A链和B链两条肽链组成,靠链间二硫键连接。和UK相比,pro-UK和纤维蛋白的亲和力较高,激活纤溶系统的部位常在血栓形成的部位,因而引起全身出血倾向的副作用要比尿激酶小,是一种更优越的纤溶酶原激活剂。Pro-UK和UK之间往往只有一个多肽键的差异,两者在分子表面特性、抗原性以及分子量方面非常相似,pro-UK也极易转化为UK，常规层析方法难以将其分离，所以细胞表达的发酵液纯化一方面要除去培养基和细胞正常代谢产物，另一方面要去除UK，因此pro-UK下游纯化非常困难。

中国专利CN1680550A公开了一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括如下4步：A、用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B、用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗品；C、用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D、用DEAE-Sepharose FastFlow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA。其中，为了达到更好地实验效果，在步骤C和D之间还可包括步骤E：用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱浓缩尿激酶原，浓缩可达10～15倍左右，以方便后续操作。

然而，该方法仍然存在蛋白纯度不高、会存在DNA、宿主细胞残留蛋白及病毒等外源性污染的问题。CN1680550A的方法安全性不高，主要原因是完成D步骤后是产品原液，原液将作为注射用重组人尿激酶原的原料进行制剂，但D步骤中所采用的Tris-HCl缓冲液将会进入到成品，直接通过静脉注射进入人体。Tris-HCl缓冲液一般只用于研究，对人体具有一定的刺激性，直接进入人体会对人体产生一定的危害，因此不适宜作为原液的缓冲体系。

为了适应临床研究，提供一种临床安全有效、副作用小、高纯度的重组人尿激酶原纯化方法是急需要解决的事情。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的CHO细胞表达的重组人尿激酶原的蛋白纯化方法，该方法得到蛋白纯度不低于98％，且有效清除了Tris-HCl缓冲液的残留，降低了临床使用风险。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明以CHO细胞表达的重组人尿激酶原发酵液为起始原料，通过纯化步骤得到一种高纯度重组人尿激酶原。

本发明的重组人尿激酶原的纯化方法，包括如下步骤：

步骤(1)蛋白捕获：尿激酶原发酵液选用阳离子交换层析法得到纯化中间体1；

步骤(2)凝胶层析：中间体1通过凝胶层析法获得纯化中间体2；

步骤(3)阳离子交换层析：中间体2通过阳离子交换层析法获得纯化中间体3；

步骤(4)亲和层析：中间体3通过亲和层析法获得纯化中间体4；

步骤(5)阴离子交换层析：中间体4通过阴离子交换层析法获得纯化中间体5；

步骤(6)阳离子交换层析：中间体5通过阳离子交换层析法获得尿激酶原原液。