[发明专利]一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法

权利要求书

1.一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：

1)样品的稀释：稀释样品，得到样品稀释液；

2)样品稀释液的高温处理：将装有样品稀释液的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，期间振荡三角瓶3～5次；

3)芽孢杆菌的分离培养；

4)指示菌的琼脂覆盖；

5)抑菌圈的观察、目标菌的挑取分离和目标菌的纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：将活化后的指示菌按照1％～5％的加入量，加入到温度为40～65℃未凝固的LB琼脂培养基或BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，使其刚好覆盖芽孢杆菌的菌落，然后进行培养，培养温度为35～42℃，培养时间为6～12h；

所述指示菌为细菌，优选单增李斯特菌CMCC54002、金黄色葡萄球菌ATCC6538、猪霍乱沙门氏菌CGMCC1.1859、大肠杆菌O157:H7ATCC43889。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，指示菌的活化步骤为：将斜面中保存的指示菌接种于LB液体培养基或BHI液体培养基，培养温度为35～42℃，培养时间为12h。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：称取样品加入到含8～10倍(优选9倍)体积无菌生理盐水的三角瓶中，35～38℃(优选37℃)充分振荡摇匀。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：将高温处理后的样品稀释液用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释102～106倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基的表面进行分离培养；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离培养的培养条件为：培养温度为35～42℃，培养时间为12～24h。

7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中：将培养后的指示菌琼脂覆盖的平板置于光线明亮处，观察芽孢杆菌菌落周围是否存在抑菌圈，将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述挑取方法为将有抑菌圈的芽孢杆菌单菌落进行挑取的步骤包括：用接种针或无菌牙签或无菌枪头穿破目标单菌落上层的指示菌琼脂，小心挑取下层琼脂中的芽孢杆菌菌落，然后在营养琼脂培养基上进行划线纯化、保存。

9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述样品为土壤、发酵食品、动物肠道内容物或粪便。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述LB琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI琼脂培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2；所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0±0.2；所述BHI液体培养基的配方为：胰蛋白胨10.0g，牛心浸粉17.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0g，磷酸氢二钠2.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。