[发明专利]一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物筛选领域，具体地说，涉及一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。

背景技术

芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，在环境中分布较广，由于在其生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等抗菌肽，对肠道或植物致病菌具有明显的抑制作用，通过降低肠道环境中游离氧、促进乳酸菌等益生微生物的生长、肠道免疫调节等发挥益生作用。基于芽孢杆菌所产抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，芽孢杆菌所产抗菌肽被广泛应用于饲料添加剂和微生态制剂的生产中，并取得了较好的应用效果。目前筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的研究报道较多，采用的筛选方法多是首先从样品中分离纯化出芽孢杆菌菌株，经培养得到无细胞培养液以后，再采用滤纸片法、打孔法、杯碟法来测试每株菌是否具有抗菌活性。虽有一些方法未经过分离纯化、制备无细胞培养液来进行具有抗菌活性细菌的筛选，如《一种快速筛选抗菌活性细菌和放线菌的方法》(申请号：201410212912.5)，但筛选的方法过于复杂，需将移液器吸头进行截取，筛选劳动强度较大。公开号为CN105002114A的中国专利申请公开了一种分离解油脂芽孢杆菌的方法，其运用高温结合指示剂显色的方法来筛选解油脂芽孢杆菌，但该技术方案中，样品需经过两到三天的间歇增氧富集培养，筛选的培养基必须在制备好LB培养基的基础上，加入混入油脂的BTB油脂培养基，再培养两天，再通过透明圈的大小来判断解油脂的能力，但此方法较为繁琐，筛选时间较长。

利用芽孢杆菌产生强耐热性的芽孢这一主要原理，通过将样品进行稀释以后进行高温处理，来杀死大量的营养细胞，只剩下芽孢能在培养基上进行生长，最终通过含有指示菌的琼脂覆盖的方法，直接进行抑菌活性的观察。为缩短筛选的时间，本方法不经过富集培养，而采用高温处理直接选择性地将样品中的芽孢进行筛选。此外，为选择特异性强的拮抗细菌，可任意选择革兰氏阳性菌或阴性菌作为指示菌。其次，针对同一环境样品，可在多个稀释度的平板中，进行抗多种指示菌的芽孢杆菌筛选，而且指示菌的活化以及琼脂覆盖的方法更为简单，芽孢杆菌抑菌圈的直径大小直接反映了其抑菌能力的强弱。这样的筛选过程极大地简化了筛选的工序，避免了先将样品进行富集培养或将细菌进行分离培养的繁琐过程，减轻了筛选的劳动强度，同时也使筛选分离到目标菌株的概率提高。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种快速筛选具有抗菌活性芽孢杆菌的方法，所述筛选方法包括如下步骤：

1)样品的稀释：稀释样品，得到样品稀释液；

2)样品稀释液的高温处理：将装有样品稀释液的三角瓶置于80～90℃的水浴锅中，水浴处理30min，期间振荡三角瓶3～5次；

3)芽孢杆菌的分离培养；

4)指示菌的琼脂覆盖；

5)抑菌圈的观察、目标菌的挑取分离和目标菌的纯化。

进一步地，所述步骤4)具体为：将活化后的指示菌按照1％～5％的加入量(优选1％)，加入到温度为40～65℃未凝固的LB琼脂培养基或BHI琼脂培养基中，充分混匀后，慢慢倒入到长有芽孢杆菌单菌落的琼脂培养基表面，使其刚好覆盖芽孢杆菌的菌落，然后进行培养，培养温度为35～42℃，培养时间为6～12h；

所述指示菌为细菌，可根据需要选择革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。所述指示菌为细菌，优选单增李斯特菌CMCC54002、金黄色葡萄球菌ATCC6538、猪霍乱沙门氏菌CGMCC1.1859、大肠杆菌O157:H7ATCC43889。其在35～42℃的培养条件下，可在琼脂覆盖后培养6～12h内观察到抑菌圈，将更为高效的对具抗菌活性的芽孢杆菌进行筛选。

作为优选，指示菌的活化步骤为：将斜面中保存的指示菌接种于LB液体培养基或BHI液体培养基，培养温度为35～42℃，培养时间为12h。

进一步地，所述步骤1)具体为：称取样品加入到含8～10倍(优选9倍)体积无菌生理盐水的三角瓶中，35～38℃(优选37℃)充分振荡摇匀。

进一步地，所述步骤3)具体为：将高温处理后的样品稀释液用无菌生理盐水进行梯度稀释，将稀释10²～10⁶倍的菌悬液涂布于营养琼脂培养基的表面进行分离培养；所述营养琼脂培养基的组成为：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH7.4±0.2。