[发明专利]一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法

权利要求书

1.一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体，其特征在于，包括消除了氯霉素抗性的pCas9载体和针对卡那霉素抗性基因kan的gRNA核酸序列，KR58或者KR208，其具体核酸序列分别如下：

KR58：GCCGCGATTAAATTCCAACA；

KR208：CAATGATGTTACAGATGAGA。

2.一种构建如权利要求1所述的消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)设计具有如上所述的核酸序列的kan基因特异性gRNA序列；

2)构建含有步骤1)所设计的gRNA序列的重组载体，构建步骤主要包括：a)根据步骤1)所设计的任一个核酸序列，人工合成一对单链DNA片段；b)对步骤a)中所得的序列组合磷酸化后退火形成双链DNA片段；c)酶切pCas9质粒后，进行琼脂糖凝胶回收；d)将步骤c)得到的pCas9质粒与步骤2)获得的双链DNA片段连接，得到重组载体；

3)去除重组载体中的氯霉素抗性基因。

3.如权利要求2所述的一种构建消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体的方法，其特征在于，步骤3)中的用于去除重组载体氯霉素抗性基因的引物的核酸序列为：

△CamF：GAAGATCTTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG；

△CamR：GAAGATCTATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGT。