[发明专利]一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原细菌学领域，具体涉及一种消除耐药基因活性的gRNA的重组载体及其构建方法。

背景技术

随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性现象越来越严重。卡那霉素属于氨基糖甙类抗生素，对金葡菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌均有效。临床上主要用于敏感菌特别是耐药性绿脓杆菌引起的尿路感染、呼吸道及肺部感染等。大肠杆菌等多种细菌含有卡那霉素耐药基因。

耐药细菌的消除是解决细菌耐药性的重要方法。环境中的耐药细菌可通过物理学或化学方法进行消毒灭菌。但生物机体内的耐药细菌只能以特异性抗菌化学或生物药物进行抑制或杀灭^[1-3]。然而，噬菌体宿主特异性太强，只能裂解某些特定型别的致病菌，还存在可能引起人体过敏的问题^[1]；细菌素抑菌菌谱太窄，规模化生产工艺尚未成熟，且也可能存在诱导耐药性问题^[2]；新型抗生素仍然是抗生素，必然存在诱导耐药性问题^[3]。因此，抑制或破坏耐药基因成为控制细菌耐药性的重要方法之一。在现有的研究中，部分中药可以消除耐药质粒基因而消除大肠杆菌耐药性^[4]，但其消除效率不高，针对10⁴的CFU/ml的大肠杆菌，耐药性消除率最高者仍不足12.5％^[4]。

近年来，一种全新的CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术的出现使我们能对任意物种的基因组进行定点编辑。CRISPR原本是细菌和古细菌中的一种适应性免疫防御系统，可保护宿主菌免受噬菌体或质粒等有害外源核酸的再次侵袭。CRISPR系统分为3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。目前Ⅱ型系统已被成功改造为人工核酸酶切系统，即CRISPR/Cas9系统，用于基因编辑，且具有制作简单、成本低、作用高效等优点^[5]。目前该技术已在科学研究中得到广泛应用，例如，人多能干细胞基因的高效敲除；斑马鱼的高通量定点基因突变和大范围分型；基因敲低小鼠的制备；修饰生殖细胞DNA以预防小鼠肌肉营养不良症；植物基因组基因编辑以及微生物基因组编辑和转录控制等。这些研究大都是对基因组上的基因进行操作，往往用于疾病的预防或治疗，基因改造有利于生物体的生存。

在将上述技术应用于抑制或破坏质粒耐药基因时，至少存在以下两个技术难点：1)耐药基因本身对细菌的生存有利，破坏耐药基因反而是对细菌的生存不利，因而必须“逆向”突破生物基因演化的阻力；2)质粒拷贝数往往较高，相应耐药基因拷贝数也同样较高，抑制破坏质粒耐药基因必须研发更为强力的核酸剪辑工具。事实上，如果控制不好，耐药基因确实可以引发CRISPR系统的突变甚至大片段缺失，使之丧失功能而得以保存对细菌有利的耐药基因^[7]。

基于上述背景，本研究选择pET-28a上的kan为靶基因，利用生物信息学技术设计了3条引导RNA(gRNA)，研究了CRISPR/Cas系统在抑制质粒耐药基因活性中的应用价值，获得了具有破坏kan基因活性的2条gRNA序列及其重组载体。

参考文献：

1.李菁华,孙延波.噬菌体疗法在耐药性细菌感染中应用的研究进展.吉林大学学报(医学版),2013,39(3):630-633.

2.章昱，周云芳.细菌素的抗细菌耐药研究及应用现状.微生物学免疫学进展，2015，43(6)：76-79.

3.李文月.细菌耐药监测与抗菌药物合理应用.中国现代药物应用，2015，9(9)：147-150

4.张鼎，李宏全，马海利，等.鸡源大肠杆菌耐药性分析及中药对大肠杆菌耐药性消除作用的研究.畜牧兽医学报，2015，46(6)：1018-1025.

5.PetersJM,SilvisMR,ZhaoD,HawkinsJS,GrossCA,QiLS.BacterialCRISPR:accomplishmentsandprospects.CurrOpinMicrobiol.2015；27:121-126.

6.CarattoliA.Plasmidsandthespreadofresistance.IntJMedMicrobiol.2013；303(6-7):298-304.