[发明专利]稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法

权利要求书

1.一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系，所述细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 ，保藏号CCTCC NO: C2015182。

2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系通过包括如下步骤的方法制备：取源于非哺乳动物的核心α(1,3)岩藻糖基转移酶基因，导入脊椎动物细胞系即得；所述的脊椎动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1。

3.一种如权利要求1所述的细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、培养CHO-K1细胞；

步骤二，取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，转染CHO-K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的转染细胞；

步骤三，取步骤二得到的转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；

步骤四，挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系，即中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1/CAF13 CCTCC C2015182。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤一包括：取100mm细胞培养皿，加入10mL新鲜F12K完全培养基，所述F12K完全培养基含10%胎牛血清及青链霉素，在培养皿中加入CHO-K1细胞，孵育。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，所述在培养皿中加入CHO-K1细胞为：按每个培养皿1.25 x 10⁶个CHO-K1细胞浓度加入细胞，之后放入CO₂培养箱中37ºC孵育过夜。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤二包括：取pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒，浓度为453ng/µL；按照每2mL Opti-Mem中含有24μg质粒和40μL Lipofectamine2000转染试剂配制转染复合物，摇匀后室温放置5分钟；取铺有CHO-K1细胞的100mm细胞培养皿加入2mL上述配制的转染复合物，摇匀后放入37ºC CO₂培养箱中继续孵育6小时；6小时后将培养皿取出，吸掉全部培养基，缓慢加入新鲜的F12K完全培养基，然后放入37ºC CO₂培养箱中培养24小时，获得转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒的CHO-K1细胞。

7.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤三包括：取转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞，使用预先加入 G418的F12K完全培养基，37ºC CO₂培养箱中进行传代培养。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是，所述步骤三包括：将转染pcDNA3.1(+)-DYK-FucTA质粒24小时后的CHO-K1细胞取出，吸掉全部培养液上清，用10mL PBS洗一遍，加入2mL胰酶消化液；室温放置并消化5-7分钟作用，吸掉胰酶消化液，再放置2-4分钟；等待期间取3个新100mm细胞培养皿，每个预先加入10mL含有800μg/mL G418的F12K完全培养基，待用；倒置显微镜下观察，待所有细胞脱壁后立刻加入10mL新鲜F12K完全培养基，缓慢吹打几遍；将细胞悬液取1/30的体积分别加入到准备的3个100mm细胞培养皿中，摇匀后放入37ºCCO₂培养箱中培养数天后；再按上述方法传代细胞一次，继续培养，待细胞群落生长出来后，挑取细胞克隆待用。

9.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤四中，所述筛选包括如下步骤：通过极限稀释法，将获得的阳性克隆细胞的单个细胞接种于96孔细胞培养板中，经过培养挑取生长健康的单克隆细胞株，并经过扩大培养并制备细胞裂解液，随后进行针对核心α(1,3)岩藻糖表位的蛋白免疫印迹，进而筛选出强阳性表达的单克隆细胞株。