[发明专利]稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法；本发明涉及的哺乳动物细胞系为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑K1/CAF13CCTCC C2015182。本发明还涉及所述细胞系的制备方法，包括如下步骤：培养CHO‑K1细胞；取pcDNA3.1(+)‑DYK‑FucTA质粒，转染CHO‑K1细胞，获得转染pcDNA3.1(+)‑DYK‑FucTA质粒的转染细胞；取转染细胞，传代培养，通过抗生素筛选获得细胞克隆；挑取细胞克隆，扩大培养并鉴定，获得强阳性表达细胞克隆，筛选，即得所述细胞系。本发明涉及的哺乳动物细胞系能够稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，实现了在哺乳动物细胞中获得并生产具有核心α(1,3)岩藻糖基化的N型糖蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的脊椎动物细胞系及其制备方法。

背景技术

现行研究显示，包括哺乳动物在内的脊椎动物没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。因此，具有核心α(1,3)岩藻糖化的脊椎动物和哺乳动物蛋白可具有新的理化特性和生物学特性，具有广阔的应用前景。例如，对复杂生物过程的理解依赖于对特定分子在包括蛋白质分子间动态相互作用在内的的定位和示踪。虽然通过对越来越多种生物的DNA测序鉴别了蛋白的开放阅读框(ORF)，但是在体内和体外对相应蛋白质性质的鉴定的方法仍是有限的。现有技术中，绝大多数致力于实现这一目标的策略基于构建一个融合蛋白，这个融合蛋白带有的融合多肽标记不仅可以用作蛋白纯化以在体外应用，也可以进一步在体内应用。研究实践中应用的标签实例包括FLAG标签、6X His标签、S－谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白和抗原决定簇标签等，但是这些标记都或多或少的改变了原有蛋白的氨基酸序列，而基于N型糖蛋白上的核心α(1,3)岩藻糖化标记则无需改变现有N型糖蛋白的氨基酸序列，且在后续对标记过的N型糖蛋白的体内外检测，示踪和/或操纵也无需制备特异的抗体，使用通用的抗核心α(1,3)岩藻糖的抗体便可以实现，使用方便。

经对现有技术的文献检索，专利文献201010607689.6(公开日2011年9月7日)披露了一种检测IgG岩藻糖化的方法及其应用。该方法利用凝集素检测位于IgG上的核心α(1,6)岩藻糖化度和位于糖链末端的α(1,3)岩藻糖化度，用于乙肝患者中慢性肝炎患者和肝硬化患者的鉴别诊断。该文献披露的技术方案不涉及蛋白核心α(1,3)岩藻糖化，不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，也不涉及核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物细胞内的表达。

如前所述，天然脊椎和哺乳动物细胞虽然具有蛋白核心α(1,6)岩藻糖化以及末端α(1,3)岩藻糖化的能力，但没有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。迄今尚未见有稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系报道。虽然部分植物和昆虫具有核心α(1,3)岩藻糖基转移酶，由于以下众多的不确定因素：限制了核心α(1,3)岩藻糖基转移酶在哺乳动物中的表达和应用：

1.不同种属的细胞糖链具有种属特性，糖链的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；2。蛋白序列也有种属特性蛋白序列的特异性可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；3。不同种属的细胞有结构特异性，细胞的基本结构可限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；4。细胞内环境pH和盐浓度，可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性；5。不同的细胞可能使用完全不同的底物系统；6。酶的细胞内分布可能限制核心α(1,3)岩藻糖基转移酶活性。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟建立一种稳定表达核心α(1,3)岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系及其制备方法。与融合蛋白标记技术相比，由核心α(1,3)岩藻糖基化标记的蛋白，不带有可引起宿主免疫反应的融合多肽，蛋白序列不发生变化；与在昆虫和植物细胞中表达的蛋白相比，并可排除由昆虫或植物细胞糖链以及蛋白酶带来的异质性。进一步的本发明的上述方法可用于其它的脊椎动物细胞。

发明内容