[发明专利]一种蛋白G金黄色葡萄球菌肠毒素试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种包被蛋白G的金黄色葡萄球菌肠毒素的ELISA检测试剂盒，属于金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素（SEs）是由金黄色葡萄球菌分泌的，能刺激中枢神经系统引起中毒反应，是食物中最重要的细菌性毒素，同时具有“超抗原”作用，可激活免疫系统。SEs分子量26～30kDa，易溶于水和盐溶液，其性质稳定，许多蛋白质酶均不能将其消化，并且十分耐热，用巴氏消毒法或一般的蒸煮方法均不能将其破坏。除了早已被鉴定出的SEA、SEB、SEC、SED、SEE等最主要的5种血清型外，近年来还发现了SEF、SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER等血清型。其中由SEA-SEE引起的食物中毒占由金黄色葡萄球菌导致的食物中毒的95%。

其中金黄色葡萄球菌肠毒素A、B是最受关注的肠毒素，据我国食品污染物和食源性疾病监测网在2003~2005年调查数据显示，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的微生物食源性疾病居第4位，其中以金黄色葡萄球菌肠毒素A引起的食物中毒最多，B型次之，C型及D型少见。A型肠毒素引起食物中毒发生率最高，B型肠毒素的毒性最强，检测这两种肠毒素对于进行食品安全检测，预防食物中毒深有意义。

为确保临床病因的诊断和食品的卫生安全，金黄色葡萄球菌及肠毒素A、B（SEA、SEB）的检测方法也一直在发展，目前已有的检测方法有动物检测法、放射免疫法、聚合酶链反应、基因探针、超抗原技术、反向乳胶凝集、免疫印迹技术等。但这些方法有些方法存在灵敏度低，特异性不强，有些存在检测局限性，检测成本昂贵等缺点，不易于推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种包被蛋白G的金黄色葡萄球菌肠毒素的ELISA检测试剂盒，这种方法灵敏度高，准确度好，操作简便。使用蛋白G预处理酶标板，可快速有效的检测待检样本中金黄色葡萄球菌肠毒素残留水平。基于ProteinG和IgG的特殊亲和力，ProteinG与抗体Fc片段结合后，Fab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗体包板，抗体在板上的结合方向是随机的，而proteinG板上的抗体具有一致方向性，抗体利用率更高。

本发明试剂盒包含：96孔酶标板、蛋白G重组蛋白、抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单克隆抗体（抗SEA抗体）、抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体（抗SEB抗体）、含辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体酶标物、样本稀释液、洗涤液、终止液。

蛋白G是经过基因优化后在大肠杆菌中重组表达的蛋白。

包被液为碳酸盐缓冲液，0.05MpH9.6CB。

ELISA封闭液为含5%BSA的0.05MpH9.6CB。

样本稀释液为0.05%Tween-20的1%明胶/PBS。

洗涤液为含0.05%Tween20pH为7.4的0.01MPBS溶液。

终止液为含1mol/LH₂SO₄。

EL1SA检测方法的建立：

1）包被ELISA板：

首先用包被液将蛋白G稀释到0.1~1μg/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育2h；

洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液（PBST）洗涤板孔，200~400μl/孔，洗涤2次；

再用10mMpH7.4PBS缓冲液将抗SEA抗体稀释到0.01~1μg/ml，100μl/孔；分别包被到ELISA微孔板内，37℃孵育0.5h；

2）洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液洗涤板孔，200~400μl/孔，洗涤2次；

3）封闭：100~200μl/孔封闭液，37℃孵育2h；

4）干燥：取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；

5）ELISA反应：每孔加入100μL样品或标准品，室温静置1h，用洗板液洗涤4次，再加入100μL的酶标抗体，室温静置1h，用洗板液洗涤4次；

6）显色：每孔加入反应底物150μL，室温避光反应15min。每孔加入50μL终止液中止反应。

7）读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。

SEB双抗体夹心法的建立同SEA。

由于采用上述技术方案，本发明除特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。

附图说明

附图1、SEA试剂盒的标准曲线图。