[发明专利]一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法及应用。

背景技术

我国是世界上农业废弃物产出量最大的国家，随着养殖业的发展，其产生的污染问题也越来越多的引起了人们的重视，对养殖业产生的废弃物加以回收利用，可以实现清洁生产。水产品加工后的下脚料具有很高的蛋白质含量。不同水产品其加工后的废弃蛋白的氨基酸组成和序列不同，因此找出能够有效酶解特定水产加工废弃蛋白的酶是至关重要的。微生物源蛋白酶由于其自身的优势已经成为当下蛋白酶研究的热点。采用微生物发酵的方法酶解水产蛋白，生产具有一定抗氧化活性的多肽，可以增加水产品加工的产值，节约资源，保护环境。而且微生物发酵法将产酶和发酵合二为一，可以大规模处理原料，是一种很有前景的利用水产加工废弃物的方式。但是目前没有专门从水产品中筛选并利用水产加工废弃物接种芽孢杆菌发酵生产抗氧化肽的具体方法

发明内容

本发明的目的是提供一种芽孢杆菌抗氧化肽的生产方法及应用，解决了现有技术中存在的缺少专门水解水产品的菌株的问题。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案：

一种利用芽孢杆菌生产抗氧化肽的发酵方法：包括如下步骤：

步骤1、制备发酵多肽液，具体为：

原料烘干；打碎；脱脂处理；脱脂后的处理：使用0.22μm规格的滤膜将原料过滤除去脂肪后，在70℃下将原料烘24h备用；加pH为6.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液灭菌；接种，种子液培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，pH7.0；接种量2％；发酵；90℃，10min灭酶；5000r/min离心，20min；

步骤2、对步骤1中发酵多肽液进行纯化，具体为：

4000r/min，20min发酵液依次经过离心，三层滤纸过滤，0.22μm滤膜过滤澄清后，取适量发酵液进行超滤转数为200rpm，依次使用截留分子质量为5kd和3kd的膜包进行超滤；当过滤至发酵液体积剩下原体积的1/5时，补加蒸馏水至原体积；此时收集滤过液并分别取滤过液和截留液适量进行多肽含量的测定，测定方法采用双缩脲法；重复补水几次并分别测定滤过液和截留液中的多肽含量，直到截留液以及滤过液中多肽含量相对恒定，即可认为小分子肽已经被滤过，而大分子肽被截流。

进一步的，所述步骤一中，原料选取鲅鱼加工边角料，鱼肉，70℃烘24h。

进一步的，所述步骤一中，脱脂处理先用乙醇体积mL：原料质量g＝1：4、再用异丙醇体积mL：原料质量g＝1：2脱脂。

进一步的，所述步骤一中，采用磷酸缓冲液灭菌的条件为温度120℃、时间30min。

进一步的，所述步骤一中，发酵条件为：4号菌最优发酵条件为：菌龄为26h，培养液初始pH为6.8，温度为30℃、料液比2.90％，发酵时间48h；其中料液比、温度、初始pH值对抗氧化活性的影响最为显著；得到的总抗氧化能力为570.11U

上述方法在制备抗氧化肽方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明所使用的发酵方法能够对水产品进行有效的发酵，且，本方法能大幅提高水产品发酵制备抗氧化肽的效果。

附图说明

图1分子量大于5000组分对DPPH自由基清除率曲线；

图2分子量3000-5000组分对DPPH自由基清除率曲线；

图3分子量小于3000组分对DPPH自由基清除率曲线；

图4分子量大于5000组分对邻苯三酚自氧化抑制率；

图5分子量3000-5000组分对邻苯三酚自氧化抑制率；

图6分子量小于3000组分对邻苯三酚自氧化抑制率。

从图1-图3可以看出，三种组分的DPPH自由基清除率都与样品蛋白质浓度成正比，其中，分子量小于3000的组分IC50最低，说明相同浓度下该组分的DPPH自由基清除效果好于其他组分。

从图4-图6可以看出，样品浓度与清除率具有一元线性回归关系，R²达到0.97以上，拟合程度很高。分子量＜3000组分的IC50值最小，为0.411mg/ml。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1芽孢杆菌抗氧化肽的分离提纯过程

步骤1、制备发酵多肽液，具体为：