[发明专利]一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法

权利要求书

1.一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法，其特征在于：将尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液在酸性条件下孵育；和

纳米过滤的步骤灭活和去除病毒，而尿激酶原原液直接被洗脱下来。

2.如权利要求1所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于：所述的低pH孵育步骤是指控制初步纯化液孵育温度，用酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，再用碱调节溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的初步纯化液。

3.如权利要求2所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于：所述低pH孵育步骤是指初步纯化液置温度稳定的恒温水浴锅内，控制初步纯化液孵育温度22-28℃，搅拌，用稀盐酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，孵育30-90min，再用1.0-4.0M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的初步纯化液。

4.如权利要求2所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于：所述的纳米滤过步骤是指孵育后的初步纯化液，进一步经过层析纯化，得到的洗脱液经过纳米膜过滤，病毒富集在纳米膜上，收集滤液即得本发明的重组人尿激酶原原液。

5.如权利要求4所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于：所述的纳米滤过步骤是指孵育后的初步纯化液，进一步经过层析纯化，得到的洗脱液经过微孔滤膜和纳米膜过滤，病毒富集在纳米膜上，收集滤液即得本发明的尿激酶原。

6.如权利要求5所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于，所述膜材料为聚偏二氟乙烯PVDF膜。

7.如权利要求2所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于，所述孵育后的初步纯化液是通过下述方法制备得到的：步骤(1)蛋白捕获：取尿激酶原发酵液上清液调节pH值至5.5～6.5后阳离子交换层柱法上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1；

步骤(2)凝胶层析：中间体1上凝胶层析柱后，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰即为纯化中间体2；

步骤(3)阳离子交换层析：中间体2调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层 析柱上样，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为初步纯化液。

8.如权利要求4所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于，所述的步骤(A)亲和层析：纯化中间体3pH值至7.0±0.5后亲和层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4；

步骤(B)阴离子交换层析：纯化中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0±0.5)按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后阴离子交换柱上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5；

步骤(C)阳离子交换层析：纯化中间体5调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为层析后的洗脱液，简称纯化中间体6。

9.一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)蛋白捕获

步骤(2)凝胶层析

步骤(3)阳离子交换层析：

步骤(4)低pH孵育：

步骤(5)亲和层析：

步骤(6)阴离子交换层析：

步骤(7)阳离子交换层析：

步骤(8)纳米过滤。

10.如权利要求8所述的纯化及去除病毒方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)中所述发酵液取上清液调节pH值至5.5～6.5后阳离子交换层柱法上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1；

步骤(2)中间体1上凝胶层析柱后，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰即为纯化中间体2；

步骤(3)中间体2调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为初步纯化液；

(4)控制初步纯化液孵育温度，用酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，再用碱调节溶液pH值7.0±0.5，即得孵育后的初步纯化液简称孵育后纯化中间体3；

步骤(5)孵育后纯化中间体3pH值至7.0±0.5后亲和层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4；

步骤(6)纯化中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0±0.5)按1：1.5-3体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后阴离子交换柱上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5；

步骤(7)纯化中间体5调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为层析后的洗脱液简称纯化中间体6；

步骤(8)纯化中间体6经过纳米膜过滤，病毒富集在纳米膜上，收集滤液即得本发明的重组人尿激酶原原液。