[发明专利]一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种尿激酶原纯化及去除病毒方法。

背景技术

尿激酶原(Prourokinase,简称pro-UK)是一类丝氨酸蛋白酶,可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶,从而溶解血栓中的纤维蛋白,因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。pro-UK中Lys158-Ile159间肽键容易被纤溶酶及其他一些酶类水解,生成尿激酶(urokinase,简称UK)。UK由A链和B链两条肽链组成,靠链间二硫键连接。和UK相比,pro-UK和纤维蛋白的亲和力较高,激活纤溶系统的部位常在血栓形成的部位,因而引起全身出血倾向的副作用要比尿激酶小,是一种更优越的纤溶酶原激活剂。Pro-UK和UK之间往往只有一个多肽键的差异,两者在分子表面特性、抗原性以及分子量方面非常相似,pro-UK也极易转化为UK，常规层析方法难以将其分离，所以细胞表达的发酵液纯化一方面要除去培养基和细胞正常代谢产物，另一方面要去除UK，因此pro-UK下游纯化非常困难。

中国专利CN1680550A公开了一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括如下4步：A、用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B、用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗品；C、用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D、用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA。其中，为了达到更好地实验效果，在步骤C和D之间还可包括步骤E：用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱浓缩尿激酶原，浓缩可达10～15倍左右，以方便后续操作。

然而，该方法仍然存在蛋白纯度不高、会存在宿主细胞DNA、宿主细胞残留蛋白及病毒等外源性污染的问题。CN1680550A的方法安全性不高，主要原因是完成D步骤后是产品原液，原液将作为注射用重组人尿激酶原的原料进行制剂，但D步骤中所采用的Tris-HCl缓冲液将会进入到成品，直接通过静脉注射进入人体。 Tris-HCl缓冲液对人体具有一定的刺激性，一般只用于研究而不能用于人体，Tris-HCl缓冲液直接进入人体会对人体产生一定的危害，因此不适宜作为原液的缓冲体系。

上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达获得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗，已于2011年作为国家一类新药成功上市。

国家食品药品监督管理局药品审评中心制定的《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》(简称原则)规定，凡是用细胞表达的人用生物制品均要求对生产用细胞株、细胞培养液、产品原液和产品进行病毒检测，并要求纯化工艺中有灭活或除去病毒的步骤，以确保产品不被病毒污染及用药安全。

为了适应临床研究，提供一种临床安全有效，副作用小、高纯度的重组人尿激酶原纯化及去除方法是急需解决的事情。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的CHO细胞表达的重组人尿激酶原的蛋白纯化及去除病毒方法，该方法得到蛋白纯度不低于98％，且清除了Tris-HCl缓冲液的残留和病毒，有效降低了临床使用风险。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明以CHO细胞表达的重组人尿激酶原的发酵液为起始原料，进行以下本发明的纯化步骤。

本发明提供了一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法，将尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液加入低pH孵育和纳米过滤的步骤去除病毒而尿激酶原直接被洗脱下来，从而达到去除病毒的目的。

所述病毒包括但不限于如细小病毒、白血病病毒和狂犬病毒等。

本发明所述的尿激酶原发酵液通过CN 1062016、CN1178244(说明书第5页7-9的方法)、公开的方法制备得到。

本发明所述的低pH孵育步骤是指控制初步纯化液孵育温度，用酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，再用碱调节溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的 初步纯化液(简称孵育后中间体3)。

所述的酸包括但不限于盐酸。

所述的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠等，优选氢氧化钠。