[发明专利]一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水产品生物检测技术领域，特别涉及一种水产品中副溶血 性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物及试剂盒。

背景技术

随着人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，已 成为重大的世界性公共问题，而病原微生物引起的食源性疾病是影响食品 安全的最主要的因素之一。副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和霍乱弧 菌(Vibriocholerae)在世界范围内被公认是两种重要的肠道致病菌。前者广 泛存在于海洋环境中，是威胁海水养殖业的主要病原菌之一，能够感染鱼、 虾和贝类等，引起虾红体病、鱼类皮肤溃疡等疾病，对水产养殖业造成重 大经济损失。人类食用该菌污染的海产品后可引起食物中毒，会有腹泻、 恶心、呕吐、发热，甚至脱水、昏迷等症状，严重的可导致败血症甚至死 亡，是日本、欧美和东南亚国家食物中毒和急性腹泻病的重要病原菌。霍 乱弧菌是环境水体自然菌群中的一种，霍乱弧菌中的O1群和O139群菌株 可以引起很严重的人类腹泻病，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水若抢 救不及时，病死率较高，属于国际检疫传染病，在我国被列为甲类传染病。 近年来，食用鲜活海产品的人群和地域在不断增多，由此两种病原菌引发 的食品安全问题也显得越来越重要。

鉴于其高度危害性，我国对人工养殖及海捕水产品中这霍乱和副溶血 性弧菌有着严格的限量要求。目前我国用于检测食品中这两种菌的国家标 准和行业标准，皆属于传统的培养及生化鉴定方法，检测周期长、工作量 大，不能满足水产品质量安全快速反应体系的需求。LAMP作为一种新的 核酸扩增技术，较其它分子生物学检测方法而言具有实验条件低、灵敏度 高和特异性强等优势，在微生物的检测中受到青睐并推广应用。该技术在 食源性致病菌的检测中已有初步研究，但都是采用单一检测，耗时长，检 测成本高。同时检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP体系未见报道。 若采用多重LAMP体系，由于存在多对引物，引物之间的干扰以及引物与 模板的错配而造成灵敏度下降与非特异性扩增反应增加等问题。

发明内容

本发明的目的在于一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重 LAMP检测引物，引物之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测 的灵敏度与特异性，既提高检测速度降又降低了检验成本。

本发明还提供了一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP 检测试剂盒，不但保持了较高的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和 经济，一次反应可检测两种致病菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的双重LAMP检测引物，包括3对 霍乱弧菌LAMP扩增引物和3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物，3对霍乱 弧菌LAMP扩增引物具体如下：

内引物ompw-FIP，序列信息见SEQIDNo.1，

内引物ompw-BIP，序列信息见SEQIDNo.2，

外引物ompw-F3，序列信息见SEQIDNo.5，

外引物ompw-B3，序列信息见SEQIDNo.6，

环引物ompw-LF，序列信息见SEQIDNo.9，

环引物ompw-LB，序列信息见SEQIDNo.10；

3对副溶血性弧菌LAMP扩增引物具体如下：

内引物toxR-FIP，序列信息见SEQIDNo.3，

内引物toxR-BIP，序列信息见SEQIDNo.4，

外引物toxR-F3，序列信息见SEQIDNo.7，

外引物toxR-B3，序列信息见SEQIDNo.8，

环引物toxR-LF，序列信息见SEQIDNo.11，

环引物toxR-LB，序列信息见SEQIDNo.12。

本发明首次开发了双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和 霍乱弧菌。针对副溶血性弧菌、霍乱弧菌分别设计3对特异性引物，引物 之间的干扰小，非特异性扩增反应少，保证了检测的灵敏度与特异性，既 提高检测速度降又降低了检验成本。本发明特别在双重LAMP扩增时引入 了特定的环引物，大大提高了扩增效率，缩短了检测时间。