[发明专利]一种过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株及其构建方法。

背景技术

骨肉瘤的致病机制是一个相当复杂的过程，是多种抑癌基因与致癌基因的失衡所致。细胞黏附分子1(Celladhesionmolecule1，CADM1)是Kuramochi等在2001年研究肺癌时，通过功能性互补的方法鉴别出的新的肿瘤抑制因子。CADM1定位于染色体1lq23.2，跨度大于300bp，含有10个外显子，由4.4kb和1.6kb大小的两个转录体编码同一种CADM1蛋白。CADM1蛋白结构上包含胞外区、跨膜区和胞质区，胞外区含3个免疫球蛋白C2型结构域，与细胞黏附有关；跨膜区域为α螺旋疏水结构；胞内区域含有两个重要的蛋白结合模序：PDZ结合模序和FERM蛋白结合模序。

研究表明，CADM1广泛参与细胞间黏附、运动及信号转导，在肿瘤的发生发展中也发挥着重要的作用，正常时起抑制细胞增殖和肿瘤发生的作用，一旦其表达降低或缺失，则失去对肿瘤细胞的转化及异常增生的阴性调节。

CADM1作为一种肿瘤抑制基因，在多种原发性肿瘤中表达减弱或缺失。目前，对于CADM1与肿瘤的关系，现有的研究大多是集中在CADM1在各种肿瘤中的表达情况、与肿瘤恶性程度及临床表现的关系、在肿瘤早期诊断及预后中的作用等，而对于CADM1是如何抑制肿瘤尤其是骨肉瘤等方面的研究较少，CADM1对于骨肉瘤的具体影响及作用机制仍然不明确。由于CADM1在多种肿瘤包括骨肉瘤中的表达是明显降低甚至是缺失的，而当前又缺少CADM1相关的生物试剂等，因而上调骨肉瘤细胞中CADM1的表达，构建稳定过表达CADM1的骨肉瘤细胞株，观察过表达后的CADM1对于骨肉瘤细胞的作用，对于研究CADM1对于骨肉瘤的影响和抑癌机制、以及研究CADM1对肿瘤的作用机制都是十分重要的。目前，尚未见到关于构建稳定过表达CADM1骨肉瘤细胞株的研究和报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株，以突破现有的关于CADM1与骨肉瘤的研究方向，通过提高骨肉瘤U-2os细胞中CADM1的表达量，实现CADM1对于骨肉瘤细胞U-2os的作用影响及抑制机制的研究。本发明的另一目的在于提供上述过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株的构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株，所述细胞含有过表达的CADM1，所述细胞是骨肉瘤细胞U-2os，保藏于中国典型培养物保藏中心（中国湖北省武汉市武汉大学），保藏编号为：CCTCCNO：C201518。

本发明的另一目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的上述过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株的构建方法如下：通过构建含目的基因CADM1质粒，经慢病毒包装后转染骨肉瘤U-2os细胞，然后用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株而构建得到过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株。

进一步地，本发明构建方法包括以下步骤：

(1)构建含目的基因CADM1质粒

通过PCR获得目的基因CADM1的片段，PCR采用的引物为：

上游引物：5’-ATGGCGAGTGTAGTGCTGCCG-3’(序列1)

下游引物：5’-GAAAGAGTACTTCATCTAG-3’(序列2)；

PCR产物经纯化后作为外源DNA片段与包含ORF序列的质粒载体连接，经转化、筛选，通过PCR重组克隆，构建得到CADM1质粒；

(2)慢病毒包装

获得目的基因慢病毒LP-S0406-Lv201-400；

(3)转染和筛选

以目的基因慢病毒LP-S0406-Lv201-400转染骨肉瘤U-2os细胞，再用嘌呤霉素浓度2μg/ml筛选稳定转染细胞株，得到过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株。

本发明具有以下有益效果：

本发明突破了现有技术关于CADM1与骨肉瘤的研究方向，克服了目前缺乏用于研究CADM1与肿瘤之间作用机制的CADM1相关生物试剂的问题，通过建立稳定过表达CADM1的骨肉瘤U-2os-CADM1细胞株，以此细胞株可直接研究CADM1对于骨肉瘤细胞的抑制作用和抑癌机制等，具有直观、真实、可稳定传代等优点，对于肿瘤治疗技术的研究和发展具有重要意义。