[发明专利]一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、CA16/EV71酶混合液、CA16/EV71阳性对照、CA16/EV71阴性对照，其中，所述内标为插入pUC18T载体的长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；所述90碱基对的序列为：

5'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAGGCAAATCTCAACAGGATCAG-3'。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下组分：

RNA提取溶液I：十二烷基硫酸钠，质量/体积0.3％～1.2％、曲拉通，体积/体积1.0％～5.0％，异硫氰酸胍0.1mol/L～1.2mol/L、50μg/ml～350μg/ml的磁珠；

RNA提取溶液II：4-羟乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L～350mmol/L、pH6.5±0.2，氯化钠150mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液III：曲拉通，体积/体积0.5％～3.0％、氯化钠100mmol/L～400mmol/L；

RNA提取溶液IV：矿物油。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为Tris-HCl0.5mol/L～1.5mol/L、EDTA0.2mol/L～1.5mol/L。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为5×PCR反应缓冲液10μl，2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸扩增的上下游引物CA16-F、EV71-F与CA16-R、EV71-R，0.1μmol/L～0.5μmol/L用于靶多核苷酸检测的探针CA16-P、EV71-P，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的上下游引物IC-F与IC-R，0.1μmol/L～0.4μmol/L用于检测内标的探针IC-P。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物以及用于靶多核苷酸检测的探针，其碱基对序列分别为：

CA16上游引物CA16-F：5'-TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3'；

CA16下游引物CA16-R：5'-ACCATTGGGTTTGGCTACG-3'；

CA16探针CA16-P：5'-FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3'；

EV71上游引物EV71-F：5'-TCCCACATTCGGAGAACACA-3'；

EV71下游引物EV71-R：5'-AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3'；

EV71探针EV71-P：5'-HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3'。

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于检测内标的上下游引物以及用于检测内标的探针IC-P，其碱基对序列分别为：

内标上游引物IC-F：5'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3'；

内标下游引物IC-R：5'-CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3'；

内标探针IC-P：5'ROX-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13'。

7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA16/EV71酶混合液为mMLV酶10U/μl～150U/μl，H-TaqDNA聚合酶1U/μl～10U/μl。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA16/EV71阳性对照品为经过标定的已知浓度的假病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copie/ml。

9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CA16/EV71阴性对照：品为经过灭菌处理的生理盐水。

10.使用根据权利要求1-9任一项所述的检测试剂盒用于检测样本中CA16/EV71-RNA的方法，包括如下步骤：

(1)试剂准备；

按照提取试剂I200μl～1ml/人份，CA16/EV71-内标1μl/人份的比例，取相应量的RNA提取溶液I及CA16/EV71-内标，充分混匀得提取溶液1-mix，瞬时离心后备用；

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按照PCR反应液38μl/人份，CA16/EV71-酶混合液2μl/人份的比例，取相应量的PCR反应液及CA16/EV71-酶混合液，充分混匀，得PCR-mix，瞬时离心后备用；

(2)RNA提取：磁珠法提取I-RNA；

S01裂解病毒：每个离心管中加入100μl～1mlRNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀，瞬时离心后备用；

S02磁珠吸附核酸：在步骤S01瞬时离心后备用的溶液中加入30μl～400μlRNA提取溶液II，震荡混匀，室温静置10～30分钟；

S03去除杂质：静止结束瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出弃用，磁珠备用；

S04洗涤：在步骤S03保留备用的磁珠内加入200μl～1mlRNA提取溶液III和100μl～400μlRNA提取溶液IV，震荡混匀，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上；

S05去除废液：静止，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置，将管底残余液体完全吸出丢弃，磁珠备用；

S06洗脱核酸：在步骤S05保留备用的磁珠中加入10μl～100ulRNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀，室温静置5～30分钟后将离心管再次置于分离器上2～5分钟，然后将洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

S07根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，每个反应管加入40μlPCR-mix，并吸取步骤S06的新的灭菌离心管中已处理的样本RNA、阴性对照、阳性对照各10μl加入PCR-mix中，盖好管盖，形成待测样品；

(3)荧光PCR反应：采用实时荧光定量PCR技术，以CA16、EV71病毒蛋白外壳VP1基因为扩增靶目标，使用所述试剂盒，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对待测样品中CA16/EV71-RNA进行定性检测；

(4)结果分析：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测CA16；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测EV71；选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；利用仪器自带的软件进行自动分析或者手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析，然后记录样本Ct值结果，根据各样本Ct值大小，判断检测结果。