[发明专利]一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸荧光PCR检测试剂盒，尤其涉及柯萨奇病毒A16型/肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，属于手足口病的体外诊断领域。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouthdisease，HFMD)又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的皮疹为主要临床特征的一种急性传染病。绝大多数HFMD患者预后良好，一般可在5～7天痊愈，属于自限性疾病。病毒还可以侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、弛缓性麻痹、心肌炎等症状，个别危重患儿可因多种原因导致死亡。该病全年均可发病，好发于夏秋季，常见于5岁以下的儿童。HFMD的主要传播途径是粪-口途径，亦可通过呼吸道传播。HFMD传染性强，易导致流行或暴发。HFMD分布极广泛，无严格地区性。HFMD全年均可发病，有明显的季节特点，以夏秋季多见。

引起HFMD的主要为小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组的4型、5型、7型、9型、10型、16型；柯萨奇病毒B组的2型、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)和肠道病毒71型。最常见为柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)及肠道病毒71型(EV71)。人对引起HFMD的肠道病毒普遍易感，各年龄组均可感染发病，但以隐性感染为主，隐性感染与显性感染之比约为100∶1。由于机体受病毒感染后，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同型病毒感染产生牢固的免疫力，因此，HFMD的患者主要为学龄前儿童，尤其是5岁以下儿童，占发病数90％以上。而大多数成人可携带病毒但不发病。1岁以内的儿童发生心肌炎、脑炎等重症的比例较1岁以上儿童高。

中国手足口病流行，1981年上海首次报道手足口病；1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发；1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71；1998年中国台湾地区129106例HFMD，其中405例为严重的中枢神经系统感染，78例死亡；1999年以来，中国广东、福建、上海、重庆等地区报告局部流行EV71感染；2007年山东临沂流行以EV71为主的手足口病；2008～2009年安徽阜阳、河南、山东等地大规模流行。主要为CoxA16和EV71共循环引起手足口病发，EV71在大部分省市为优势病毒。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测CA16、EV71RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1)检测灵敏度低，约在1000copie/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copie/ml～1.00E+07copie/ml之间，对于临床高值(大于5.00E+07copie/ml)和低值(小于1.00E+03copie/ml)的样本无法检测；2)对于CA16/EV71的不同亚型存在一定的漏检现象；3)酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4)无法有效去除样本中的PCR抑制物(如：全血、痰液等)，体系中一般没有阳性内对照(即内标)，无法预防假阴性；5)国外试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。6)国内大部分试剂只能做单管检测，检测2个型需要用两管反应液。

发明内容

本发明的目的在于解决现有柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高、检测范围宽而准确的CA16/EV71核酸荧光PCR检测试剂盒，可以对咽拭子等未知样本中的CA16/EV71-RNA在一管反应液中进行快速、准确检测，并且可以区分CA16和EV71基因型，检测结果可用于CA16/EV71感染的辅助诊断。

本发明实施例中提供了一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组分：RNA提取溶液、RNA洗脱液、内标、PCR反应液、CA16/EV71酶混合液、CA16/EV71阳性对照、CA16/EV71阴性对照，其中，所述内标为插入pUC18T载体的一段长为90碱基对的人工合成DNA序列的重组体，其浓度为1.00E+03copies/ml～1.00E+06copies/ml；所述90碱基对的序列为：