[发明专利]CHO细胞基因拷贝数的微滴数字PCR定量检测方法

权利要求书

1.CHO细胞基因拷贝数的微滴数字PCR定量检测方法，其特征在于，步骤包括：

1)提取CHO细胞基因组DNA；

2)用限制性内切酶对步骤1)提取的基因组DNA进行酶切处理；

3)进行微滴数字PCR反应；

4)PCR反应结束后，测定PCR反应板每孔样品的阳性微滴、阴性微滴数目，获得CHO细 胞的基因拷贝数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)，使用DNeasyBlood&TissueKit 提取基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，所述限制性内切酶为MseI。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)，酶切体系为：10×酶切缓冲液 10μl，限制性内切酶25U，25ng/μl的基因组DNA2.5μg，补双蒸水至100μl。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，PCR反应体系为：2×ddPCRSuperMix 12.5μl，90μM目的基因正向引物0.5μl，90μM目的基因反向引物0.5μl，90μM参照基 因正向引物0.5μl，90μM参照基因反向引物0.5μl，100μM目的基因探针0.05μl，100μM 参照基因探针0.05μl，基因组模板2μl，双蒸水8.4μl，总体积25μl。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)，所述目的基因包括重链基因和 轻链基因；所述重链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.12所示，反向引物的序列如SEQID No.13所示，探针的序列如SEQIDNo.14所示；所述轻链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.15 所示，反向引物的序列如SEQIDNo.16所示，探针的序列如SEQIDNo.17所示；所述参照 基因为B2M基因，该参照基因的正向引物的序列如SEQIDNo.3所示，反向引物的序列如SEQ IDNo.4所示，探针的序列如SEQIDNo.5所示。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)，PCR反应条件为：95℃，2min； 94℃，30s，60℃，1min，共40个循环；98℃，10min。

8.用于权利要求1所述方法的引物组，其特征在于，包括：重链基因的正向引物、重链 基因的反向引物、轻链基因的正向引物、轻链基因的反向引物、参照基因的正向引物、参照 基因的反向引物；所述重链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.12所示，反向引物的序列如 SEQIDNo.13所示；所述轻链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.15所示，反向引物的序 列如SEQIDNo.16所示；所述参照基因的正向引物的序列如SEQIDNo.3所示，反向引物的 序列如SEQIDNo.4所示。

9.用于权利要求1所述方法的探针组，其特征在于，包括重链基因的探针、轻链基因的 探针和参照基因的探针；所述重链基因的探针的序列如SEQIDNo.14所示；所述轻链基因的 探针的序列如SEQIDNo.17所示；所述参照基因的探针的序列如SEQIDNo.5所示。