[发明专利]CHO细胞基因拷贝数的微滴数字PCR定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别是涉及CHO(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细 胞)细胞基因拷贝数的定量检测。

背景技术

微滴数字PCR，即DropletDigitalPCR(ddPCR)，可实现核酸分子的绝对定量。在ddPCR 实验中，PCR体系被平均分配到若干个均匀的油滴中，有的油滴不含目的基因片段，有的油 滴则含有一个或者多个目的基因片段。ddPCR一般使用荧光标记的探针来检测目的基因片段 的扩增量，反应体系类似于荧光定量PCR(qPCR)，即含有DNA聚合酶、dNTP、模板、引物、 荧光标记的探针等。PCR体系被微滴化处理后，将进行终点式PCR反应。PCR完成后，使用特 定的微滴分析仪器检测荧光阳性微滴和荧光阴性微滴的数目。根据阳性微滴的比例，可使用 泊松分布计算出样品中目的基因的绝对拷贝数。

作为第三代PCR技术，ddPCR在拷贝数变异、突变检测、基因表达研究等领域有着重要 应用。在进行基因拷贝数的绝对定量时，ddPCR相对于qPCR有着更高的灵敏度和精确度，并 且不依赖于标准曲线。然而，使用ddPCR检测细胞或组织样品中目的基因在染色体上的绝对 拷贝数时，仍需要选择一个拷贝数已知的基因作为参照基因。另外，由于目的基因和参照基 因一般在同一个反应体系中进行扩增，两者的引物和探针需要有足够的特异性，不能相互干 扰。

在ddPCR实验中，模板的上样量至关重要。为了保证准确的检测，平均每个微滴中目的 基因的拷贝数不应超过5个。另一方面，模板上样量过低，也会造成实验误差过大。因此， 对于不同的样品，需要对模板的上样量进行摸索。ddPCR实验的另外一个关键点是模板的酶 切处理。如果两个或者多个目的基因位于同一个DNA片段上(质粒、染色体等)，为了达到精 确的检测，使用限制性内切酶将目的基因分离开是必须的。限制性内切酶的选择需要满足以 下几个条件：(1)该酶能够将连接在一起的目的基因分离开；(2)目的基因和参照基因的扩 增区域内不能含有该酶切位点；(3)该酶的活性不能受到DNA甲基化的影响。在实际的检测 中，需要根据实际情况选择合适的限制性内切酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种CHO细胞基因拷贝数的微滴数字PCR定量检测 方法，它可以提高基因拷贝数定量检测的灵敏度和精确度。

为解决上述技术问题，本发明的CHO细胞基因拷贝数的微滴数字PCR定量检测方法，步 骤包括：

1)提取CHO细胞基因组DNA；

2)用限制性内切酶对步骤1)提取的基因组DNA进行酶切处理；

3)进行微滴数字PCR反应；

4)PCR反应结束后，测定PCR反应板每孔样品的阳性微滴、阴性微滴数目，获得CHO细 胞的基因拷贝数。

较佳的，上述步骤1)，使用DNeasyBlood&TissueKit提取基因组DNA。

较佳的，上述步骤2)，限制性内切酶使用MseI。

较佳的，步骤2)，酶切体系为：10×酶切缓冲液10μl，限制性内切酶25U，25ng/μl 的基因组DNA2.5μg，补双蒸水至100μl。

较佳的，步骤3)，PCR反应体系为：2×ddPCRSuperMix12.5μl，90μM目的基因正向 引物0.5μl，90μM目的基因反向引物0.5μl，90μM参照基因正向引物0.5μl，90μM参 照基因反向引物0.5μl，100μM目的基因探针0.05μl，100μM参照基因探针0.05μl， 基因组模板2μl，双蒸水8.4μl，总体积25μl。其中，所述目的基因包括重链基因和轻链 基因；所述重链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.12所示，反向引物的序列如SEQIDNo.13 所示，探针的序列如SEQIDNo.14所示；所述轻链基因的正向引物的序列如SEQIDNo.15 所示，反向引物的序列如SEQIDNo.16所示，探针的序列如SEQIDNo.17所示；所述参照 基因为B2M基因，该参照基因的正向引物的序列如SEQIDNo.3所示，反向引物的序列如SEQ IDNo.4所示，探针的序列如SEQIDNo.5所示。

较佳的，步骤3)，PCR反应条件为：95℃，2min；94℃，30s，60℃，1min，共40个循 环；98℃，10min。