[发明专利]一种利用人自体骨髓间充质干细胞制备组织工程体的方法

说明书

技术领域

本发明属于再生医学技术领域，涉及采集、分离、培养、扩增和冻存骨髓间充质干 细胞，以及利用扩增后的骨髓间充质干细胞进行组织工程体的构建。

背景技术

人体是由各种组织器官组成的，不同的组织在人体中起着不同的作用。随着人年 龄的增加，各组织功能会逐渐衰退导致其不能发挥正常的作用。还有一些由于某些疾病或 者外在创伤导致组织器官受损，从而丧失了功能性。由于这些原因组织无法为人体提供正 常的生理功能，进而会影响到其他部位的身体机能。因此，通过外界因素修复或者替换受损 组织，成为治疗组织病变或衰退的途径。

目前临床上主要运用高分子材料、金属材料等人造组织替换人体受损部位组织。 经过多年的研究改进，这些材料制备的组织工程体在实用性和功能性上已经体现较好的水 平。但随着人们生活水平的提高，这些方法仍表现了不足之处。如临床上常用的人造血管， 从早期的涤纶材料已经演化为高品质的PU材质，但研究表明PU材质的人造血管长期在体 内，会发生钙化和老化降解等不良现象，导致血管破裂，使得患者需要进行二次手术。此外， 人工关节已经成为严重关节损伤患者治疗的主要方法，但术后感染、静脉栓塞等问题仍无 法很有效的解决。目前人工关节材质主要为合金或高分子材料，术后人运动性远不如人体 自身组织。还有临床上常见的皮肤移植手术，目前常用的是利用动物胶原组织制备的人工 皮肤，一方面由于来源为动物组织，可能产生一些风险，另一方面，移植后的人工皮肤组织 相容性、生物形态与自身皮肤组织有很大差异，会伴随发生一些感染现象。如何制备一种与 人自身组织更相似的组织工程体，已经成为近年来研究的重点。

骨髓间充质干细胞，属于干细胞的一种，经国内外长期大量研究，其具有分化成多 种类型细胞的潜能，最终可分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和神经细胞等。这 为利用BMSCs制备不同类型的组织工程体提供了理论依据。此外，BMSCs本身具有较低的免 疫原性，利用BMSCs制备的TEC比动物来源的组织具有更高的安全性。BMSCs还具有较高的增 殖性，体外培养时，可在短时间内获得大量的BMSCs，为制备组织工程体提供了原材料。

本发明采用人自体BMSCs，从来源上讲更容易获取。同时，进一步提高了过程的安 全性。由于BMSCs属于人体自身组织，利用其制备的组织工程体具有很好的组织相容性和生 理学特性，植入人体后可以达到原组织损伤前的生理功能指标。与异种材料相比，术后患者 也不会有明显的异物感存在，极大程度提高了患者的生活质量。为临床治疗开辟了一条更 好地治疗途径。利用BMSCs制备TEC也为今后人造器官的制备提供了很好的研究基础。

目前MSCs已经在临床骨伤疾病软骨损伤修复治疗中显示出理想的效果，特别是在 关节镜治疗后利用MSCs对骨和软骨的修复成为新的临床技术。TECs为这种治疗方法提供了 技术和临床效果的保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用自体骨髓间充质干细胞制备组织工程体，该方 法所用的细胞获取便捷，制备的各种组织工程体其形态良好，具有完全生物相容性，临床使 用后患者无异常状况。

为达到发明目的，本发明所采用的技术包括：人自体骨髓有核细胞的采集、分离与 BMSCs的培养、扩增和冻存，以及利用扩增后的BMSCs制备TEC。

所述BMNCs的采集步骤包括：在骨髓采集前采集自身外周血250ml。在局部麻醉情 况下，从髂后上肌采集骨髓30-50ml，分两侧采集，每侧采集三点，每点采集10ml骨髓。

富含血小板血清裂解液（PRP）的制备：将血袋中的外周血转移到50ml离心管内进 行离心分离，离心后上半部分为血清，下半部分为红细胞，若血清部分不足50%，要再次离 心。用PBS进行稀释对血小板进行计数后，将PRP分装到若干15ml离心管内4℃暂存，长期储 存要放在-20℃下。

所述BMNCs的分离步骤包括：利用重力离心法将骨髓离心后呈3层，上半部为透明 层，下半部含有红细胞呈现红色，中间区域是有核细胞薄层，利用移液管轻轻将有核细胞层 移除。重复以上步骤以得到更多有核细胞。进行细胞计数，包括有核细胞和红细胞，然后根 据细胞计数进行BMNCs培养。