[发明专利]一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系及方法

权利要求书

1.一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全 基因组的引物对:

U_AIV-F：AGCRAAAGCAGG；

U_AIV-R：AGTAGAAACAAGG。

2.如权利要求1所述的扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，还包括扩增 禽流感病毒8个节段的引物对：

PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC；

PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；

PB1-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG；

FB1-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；

PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC；

PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；

HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；

HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；

NP-F：AGCRAAAGCAGGGTT

或AGCRAAAGCAGGGTTA；

NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT；

NA-F：AGCAAAAGCAGGAGT；

NA-R：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；

M-F：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；

M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT；

NS-F：AGCAAAAGCAGGGTGAC；

NS-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。

3.一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，以如权利要求1所述的U_AIV-F和 U_AIV-R为引物对病毒RNA进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应体系如下：10.0 μL病毒RNA、10.0μL5*buffer、10.0μL10mMdNTP、1.0μLU_AIV-F、1.0μL U_AIV-R、1.0μL酶、DEPCH₂O补足50.0μL；

其中，U_AIV-F与U_AIV-R的浓度均为10pmol/μL。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其RT-PCR反应条件如下：58℃ 30min，94℃预变性3min，然后加入循环：94℃30s，48℃30s，72℃7.0min； 进行35个循环后，72℃10min。

6.一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括以下步骤：

1)cDNA的合成：以RT引物AGCRAAAGCAGG为反转录引物，对病毒 RNA进行PCR，合成cDNA；

2)8个节段的扩增：以cDNA为模板，分别使用权利要求2所述的8个节 段的引物对进行PCR反应，分别得到禽流感病毒全基因组8个节段的PCR产物；

3)拼接：将PCR产物进行凝胶电泳分离，检测，目的条带送交测序或克 隆后测序，拼接，得到禽流感病毒全基因组。

7.如权利要求6所述的方法，步骤2)中，PCR反应体系如下：12.5μLTakara premixExTaq、0.5μLF引物、0.5μLR引物、cDNA0.5μL、灭菌双蒸水补足 25.0μL；

所述F引物和R引物的浓度均为10pmol/μL。

8.如权利要求6所述的方法，其PCR反应条件如下：95℃预变性5min， 然后进入循环：94℃30s，48-58℃30s，72℃1-3min，35个循环后，72℃10min。