[发明专利]一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系及方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于分子生物学技术领域，具体涉及一种扩增禽流感病毒全基 因组的引物体系及方法。

背景技术

流行性感冒病毒简称流感病毒，是危害最大的人兽共患病病原，至今不仅 给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏，造成巨大的经济损失，而且常引起世界性 人流感大流行，严重危害人类生命健康。流感病毒分为A、B、C三型，其中A 型流感病毒危害最大，分布最广，且以禽为敏感宿主。A型禽流感病毒基因组 分为8个节段PB2/PB1/PA/HA/NP/NA/M/NS，表达12种蛋白，这12种蛋白分 别在病毒吸附、融合、转录翻译及新一代病毒粒子释放中各司其职。其中诱导 家禽等宿主机体产生中和抗体的主要表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)、 神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)种类分为不同亚型，迄今所发现有17个HA 亚型(H1～H16)，10个NA亚型(N1～N10)，HA/NA的多亚型、不断变异， 以及内部基因的交叉重组给流感病毒防治带来困难。

尤其是近年来出现的H5N1亚型禽流感、以及2009年的H1N1大流感、2013 年3月出现的新亚型禽流感H7N9等事件愈演愈烈。目前，H10N8、H5N6、H5N8 等众多新亚型不断出现。这种频繁变异重组给传统的HI检测、特异HA/NA引 物检测方法带来了困难。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用性广的扩增各 亚型禽流感病毒全基因组的引物体系。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种扩增禽流感病毒全基因组的引物体系，包括1对扩增禽流感病毒全基 因组的引物对:

U_AIV-F：AGCRAAAGCAGG；

U_AIV-R：AGTAGAAACAAGG。

作为优选，还包括扩增禽流感病毒8个节段的引物对：

PB2-F：AGCRAAAGCAGGTCAATTATATTC；

PB2-R：AGTAGAAACAAGGTCGTTT；

PB1-F：AGCRAAAGCAGGCAAACCATTTG；

FB1-R：AGTAGAAACAAGGCATTT；

PA-F：AGCRAAAGCAGGTACTGATCC；

PA-R：AGTAGAAACAAGGTACTT；

HA-F：AGCRAAAGCAGGGGT；

HA-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；

NP-F：AGCRAAAGCAGGGTT

或AGCRAAAGCAGGGTTA；

NP-R：AGTAGAAACAAGGGTATTTTT；

NA-F：AGCAAAAGCAGGAGT；

NA-R：AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；

M-F：AGCRAAAGCAGGTAGATATTG；

M-R：AGTAGAAACAAGTAGTTTTTT；

NS-F：AGCAAAAGCAGGGTGAC；

NS-R：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT。

一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，以上述U_AIV-F和UAIV-R为引物对 病毒RNA进行一步法RT-PCR，得到禽流感病毒全基因组。

作为优选，上述方法的RT-PCR反应体系如下：10.0μL病毒RNA、10.0μL 5*buffer、10.0μL10mMdNTP、1.0μLU_AIV-F、1.0μLU_AIV-R、1.0μL酶、DEPC H₂O补足50.0μL；

其中，U_AIV-F与U_AIV-R的浓度均为10pmol/μL。

作为优选，上述方法的RT-PCR反应条件如下：58℃30min，94℃预变性 3min，然后加入循环：94℃30s，48℃30s，72℃7.0min；进行35个循环后，72℃ 10min。

一种扩增禽流感病毒全基因组的方法，包括以下步骤：