[发明专利]β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程的技术领域，具体说是一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。

背景技术

β-胡萝卜素分子式为C₄₀H₅₅，是合成维生素A的前体物质，是一种抗氧化剂，具有解 毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上具 有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。

目前生产β-胡萝卜素的方法主要有植物提取法，化学合成法，微生物发酵法。植物 提取法是指从胡萝卜等富含β-胡萝卜素的植物中提取β-胡萝卜素，化学合成法是以化学原料 化学法合成β-胡萝卜素。微生物发酵法是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵 生产β-胡萝卜素。其中，以三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。

三孢布拉氏霉属于霜霉目，白锈科，拉丁名是Blakeseleatrispora，有性无性繁 殖，有（+）（）两种接合型，即正负两种菌株，单独的（+）或（）菌发酵产β-胡萝卜素的能力很低， 低于45mg/L。（+）、（）菌株在PDA平板上形成白色菌落，没有明显的产色素能力。

正负菌株按不同比例混合后发酵，会产生较多的β-胡萝卜素。其中，正负菌株按1:4 混合后产量最高，达到了350mg/L。

三孢布拉氏霉在平板上生长呈蔓延状，菌丝生长快，较难挑取纯菌落。在培养基中 添加0.05%的OP乳化剂，限制菌丝蔓延，获得较规则的菌落，便于挑取得到较纯菌株。

US7252965B2公开了一种利用六十细胞仪来筛选β-胡萝卜素高产菌种的方法。将 孢子悬液经紫外线照射后，用流式细胞仪来处理诱变后的孢子液。通过分析孢子产生的特 定荧光强弱，来判断其产β-胡萝卜素能力的大小。荧光越强，生产能力越强。利用这种方法， 筛选到了一株高产菌株，产量达到9g/L。

CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下 步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌 是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基 因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途 径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途 径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β-胡萝卜素的产量。

CN101096355一种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法，公开了一种从新鲜胡萝卜 中提取天然β-胡萝卜素的工艺。所述的方法是新鲜胡萝卜经过绞汁以后，倒入高压均质机中 均质，均质后的胡萝卜浓汁中加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇，经过离心，弃去 上清液，得到橙红色沉淀；将沉淀经过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状干燥的沉淀，在沉 淀中加入有机溶剂石油醚萃取其中的β-胡萝卜素，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂，得到 β-胡萝卜素油状物。所提得的β-胡萝卜素纯度达90％，提取量达180mg/100g，提取率可达80％ 以上。该法具有工艺新颖，操作简单，成本低等特点，对研究开发从新鲜胡萝卜中提取天然β- 胡萝卜素具有很高的参考价值。

CN1558953公开了三孢布拉霉的β－胡萝卜素的生物合成基因，其编码番茄红素环 化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)。carRP基因，其特征在于 DNA序列SEQIDNO：1，编码氨基酸序列SEQIDNO：3，其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素 合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQIDNO：2，编码氨基酸序列SEQIDNO：4，其具 有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及(i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方 法和(ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。