[发明专利]一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法

权利要求书

1.一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆

以牵牛花成熟种子为材料，采用改良Trizol法提取总RNA，经Ferments公司反转录试剂盒合成第一链cDNA后，采用RT-PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全长分别为279bp和276bp，编码92个氨基酸和91个氨基酸，AFP1和AFP2同源性高达95%以上，均含有41个氨基酸的小分子信号肽；

（2）植物表达载体构建

设计带酶切位点的引物，以第一链cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因AFP1和AFP2，通过定向酶切与载体pISV2678连接，并电击转化农杆菌EHA105，构建含有目的基因AFP1和AFP2的植物表达载体；

（3）农杆菌介导法转化剑麻

以剑麻H.11648愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法浸染愈伤组织，然后将浸染后的愈伤组织接种在含有卡那霉素kan⁺和除草剂Basta的不定芽诱导培养基上诱导不定芽，待不定芽长到4-6厘米高时，转入生根培养基上进行生根，待再生植株长出4-5条壮根时，移植到基质为椰糠和河沙的塑料遮光大棚中继续培育；

愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基+0.1-1.0mg/L萘乙酸NAA+1.0-3.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤6-BA，不定芽诱导培养基为：SH基本培养基+1.0-5.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤6-BA+0-1.5mg/L萘乙酸NAA+0-1.5mg/L吲哚3丁酸IBA+200mg/L卡那霉素kan⁺+250μg/L除草剂Basta，生根培养基为添加200mg/L羧苄霉素的MS基本培养基；

（4）剑麻转化植株的鉴定

取1克转基因植株叶片提取基因组DNA，以DNA为模板，以AFP-F和AFP-R为引物，以非转基因植株为阴性对照，经PCR检测后发现基因AFP1和AFP2已经成功转入剑麻；

引物AFP-F：5’-CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC-3’；

引物AFP-R：5’-CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG-3’；

（5）剑麻转化植株抗病性检测

采用叶面针刺法活体和离体接种烟草疫霉菌，48小时候后观察病斑扩展情况，发现转基因植株叶片病斑明显比非转基因植株小；

（6）剑麻转基因植株重要防御酶活性测定

采用叶面针刺法活体接种烟草疫霉菌，在接种0小时、24小时、48小时和72小时分别测定转基因和非转基因植株超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT和多酚氧化酶PPO的活性，发现转基因植株参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶PPO的活性明显比非转基因植株高。

2.根据权利要求1所述一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：步骤（3）所述培养基的pH为5.8-6.0；光照12-14h，黑暗10-12h，光照强度为2000Lux，温度28±2℃。

3.根据权利要求1所述一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：步骤（3）所述椰糠和河沙的质量比为1:1。