[发明专利]一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，具体涉及一种从牵牛花中克隆橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2及其在提高剑麻抗性中的应用，尤其适用于在剑麻抗斑马纹病中的应用，属于转基因技术领域。

背景技术

剑麻是主要的热带纤维作物，是当今世界用量最大、范围最广的一种硬质纤维，其纤维质地坚韧，具有拉力强、抗撕裂、耐磨、耐腐蚀、耐盐碱等特性，广泛应用于国防、航海、交通运输、石油、冶金等领域，剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料，剑麻麻渣含有较高皂素，可用来制药，同时剑麻也是一种重要的生物质能源，有非常重要的经济价值。

剑麻原产于墨西哥等热带、亚热带地区，我国保存的种质资源有80余份，种质资源严重缺乏。目前的主栽品种H.11648是1963年从坦桑尼亚引进，其种植面积占剑麻总面积的98%以上。由于该品种抗真菌能力差，加上单一品种多年种植，品种退化严重，病虫害不断滋生，严重影响了剑麻产业的发展，因此培育出抗病高产品种或对现有品种遗传改良已迫在眉睫。

剑麻生命周期长，一生仅开一次花，花期不遇现象普遍存在，加上我国剑麻种质资源严重缺乏，多倍体广泛存在，要在短期内培育出高产抗性强的品种十分困难。因此，寻求高效快速的方法便成了育种学家们的首要任务，同时也是剑麻产业中的主要问题之一。

随着分子生物学的迅速发展，各种技术方法日益成熟和完善，利用基因工程技术对现有种质资源进行遗传改良已广泛应用于作物育种中，并在拟南芥、番茄、马铃薯、水稻等作物中已有许多成功的报道，同时也为剑麻生物技术育种提供了参考。

植物多肽抗生素是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制或杀灭作用的小分子多肽，其结构和组成复杂多样，目前已发表的植物多肽抗生素主要有荠菜素、环肽、脱皮素、硫素、植物防御素、转脂蛋白、橡胶素、打结素和凤仙花素，其中橡胶素为含有29-44aa，可能含有3对、4对或5对二硫键的小分子多肽。研究表明橡胶素对革兰氏阳性菌和真菌表现出抗性。曾有报道称，在千穗谷苋菜中克隆了一个橡胶素类多肽Ah-AMP2基因，该基因在烟草中表达后，可提高烟草对烟草青枯病和黑胫病的抗性。

剑麻斑马纹病主要致病菌为烟草疫霉，田间病株多数从叶片开始，进而麻茎、叶轴均会受到侵染，引起叶片坏死、茎腐和轴腐，进而导致整株死亡，此病迅速蔓延，极易造成极大经济损失。传统的防治方法还是采用农业措施、化学药剂防冶相结合的综合防冶措施，从牵牛花中克隆橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2用于提高剑麻抗性还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，本方法通过基因工程手段，将外源基因导入剑麻中，通过转基因技术获得具有一定抗性的转基因剑麻植株，本发明为提高剑麻斑马纹病的抗性提供了一条新的有效途径。

为实现上述目的，本方法采用的技术方案是：

1.橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆

以牵牛花成熟种子为材料，采用改良Trizol法提取总RNA，经Ferments公司反转录试剂盒合成第一链cDNA后，采用RT-PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全长分别为279bp和276bp，编码92个氨基酸和91个氨基酸，AFP1和AFP2同源性高达95%以上，均含有41个氨基酸的小分子信号肽。AFP1和AFP2核酸和氨基酸序列见SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。

2．植物表达载体构建

设计带酶切位点的引物，以第一链cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因AFP1和AFP2，通过定向酶切和与载体pISV2678连接，并电击转化农杆菌EHA105，构建含有目的基因AFP1和AFP2的植物表达载体。表达载体图谱见附图1。

3．农杆菌介导法转化剑麻