[发明专利]一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪传染性胃肠炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis,TGE)是一种由α-冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（transmissivlegastroenteritisvirusofswine,TGEV）引发的猪的一种高度接触传染性疾病。该病毒可在易感动物小肠绒毛上皮细胞上复制，导致细胞变性、绒毛缩短等并引起营养吸收障碍和腹泻。不同年龄和品种猪均易感。新生仔猪感染TGEV后20h内呈现胃肠炎症状，在1-4d死亡，1周龄仔猪感染后死亡率可达100％。

猪传染性胃肠炎（TGE）是一种世界范围内流行的疾病，美国的Doyle和Hutchings1946年首次道了TGE，之后日本、英国、加拿大、朝鲜等许多国家相继报道了本病，呈现世界性分布。我国从20世纪50年代末期就有该病的报道，近年来全国各地区地区时有发生与流行，并且经常伴随着与猪轮状病毒病和猪流行性腹湾病的混合感染，目前无有效的治疗药物，因此给我国养猪业造成了极大地经济损失。由于TGE的发病日龄小，感染率、死亡率高，世界动物卫生组织（OIE）已将其列为B类疾病中必检的传染病。因此，很有必要对猪传染性胃肠炎的快速诊断方法进行研究来有效而快速地防控TGE。

对猪传染性胃肠炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪传染性胃肠炎的关键。目前已建立了病毒分离、免疫电子显微镜技术（IEM）、血清学试验、核酸探针和聚合酶链反应（PCR）等方法。传统的病毒分离鉴定方法尽管可以作为确诊该病的最终诊断依据，但其操作时间长，过程复杂，不适于快速检测要求。IEM、核酸探针和PCR等技术具备敏感性高及特异性强等优点，但对试验条件要求比较高，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，且操作相对复杂，检测成本高，只有专业检测实验室才能配备，基层单位难以开展容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决基层检测猪传染性胃肠炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；

其中：

F3TCAACAGATTGGTTATTGGAAT

B3ATTAGCACCACGACTACC

FIPAGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA

BIPGTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC

LFCTCTTTACGTTGGCCCTTCAC

LBGATGGAGTTGTCTGGGTTGC

所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的猪传染性胃肠炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA，自猪病变组织样品或粪便中提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO₄15-20mM、(NH₄)₂SO₄15-25mM、Tween200.4-0.8%、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪传染性胃肠炎病变组织或猪粪便排泄物中是否含有猪传染性胃肠炎病毒，具体检测步骤包括：