[发明专利]一种BRAF V600E基因的检测引物组、其构成的反应体系及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种BRAFV600E基因的检测引物组、其 构成的反应体系及应用。

背景技术

BRAF全称为鼠肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF家族的成员之一，定位于人染 色体7q34，是一种原癌基因，其编码产物是一个94KDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(B-raf)。 B-raf主要存在于睾丸组织和神经组织，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中重要的转导因子， 参与调控细胞生长、分化和调往等重要的细胞事件。B-raf由783个氨基酸残基组成，其功能 的活化依赖于特点位点的氨基酸残基的磷酸化，其中位于CR3区的T598和S601的磷酸化对 于B-raf蛋白的激活至关重要，只有当这两个位点均磷酸化后，B-raf才能被完全激活。在多 种人类的恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌及肝癌中，均存在不同比 例的BRAF突变，其中尤以V600E(c.1799T>A)突变最为常见，约占所有突变比例的86％。 V600E突变能够模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使B-raf处于持续活化的状态。由 于B-raf是位于K-ras下游级联信号通路上的一个重要蛋白，因此当B-raf发生突变后，其编 码产物无需接受K-ras的活化信号便处于激活状态，使得EGFR抑制剂西妥昔单抗和帕尼单 抗的治疗效果减弱甚至无效。同时，一种威罗菲尼已被FDA批准用于治疗V600E突变阳性的 不可手术的转移性黑色素瘤患者。由于肿瘤存在异质性，而且取样标本中往往混入大量的 正常组织，再加上石蜡标本提取的基因组DNA质量有限，因此可能会导致检测结果可的假阴 性。目前用于检测BRAF基因突变的方法主要有Sanger测序法、焦磷酸测序法和荧光定量PCR 法，它们的灵敏度依次升高。测序法耗时长，操作繁琐，灵敏度低，且依赖非常昂贵的进口设 备，不易于大规模推广；荧光定量PCR法灵敏度较好，但同样依赖昂贵的检测设备和探针，因 此检测费用一直居高不下，然而患者的检测又势在必行，因此亟需我们开发一种既快速灵 敏又成本低廉的检测方法。

环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术， 其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。具有 敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易于判定的优点。

发明内容

本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种BRAFV600E基因的检测引物组、其构 成的反应体系及应用，所述检测体系具有敏感性高、特异性好和操作简便等优点。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种BRAF基因的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组 如下：

正向外侧引物F3：SEQIDNO:1；

反向外侧引物B3：SEQIDNO:2；

正向内侧引物FIP：SEQIDNO:3；

反向内侧引物BIP：SEQIDNO:4。

所述检测引物组的核苷酸序列如下：

正向外侧引物F3：SEQIDNO:1：TGCTCTGATAGGAAAATGAGA；

反向外侧引物B3：SEQIDNO:2：GGCCAAAAATTTAATCAGTGG；

正向内侧引物FIP：SEQIDNO:3： CTATGTAGCTAGACCAAAATCACCTGTTTTCCTTTACTTACTACACCT；

反向内侧引物BIP：SEQIDNO:4： AATCTCGATGGAGTGGGTCCAAAATAGCCTCAATTCTTACCAT。

本发明中，外侧引物记为正向外侧引物F3和反向外侧引物B3，内侧引物记为正向 内侧引物FIP和反向内侧引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2，上述引物均 由在线软件PrimerExplorerV4设计。本发明在普通LAMP的基础上，以特异性要求最严格的 F1c的5’端引入特异引物，为进一步加强引物的特异性，通过在F1c的5’端第三位引进额外 突变，进一步降低非特异性扩增的可能性。