[发明专利]一种提取衣藻中脂蛋白的方法

权利要求书

1.一种提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，破碎处理，首先将营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞溶液离心收集沉淀，然后加入包含蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物的Hepes-KOH缓冲液重悬细胞沉淀，之后将细胞破碎，匀浆中加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤2，活性剂清洗，用包含0.1％～0.2％的吐温-20和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤1收集的油脂，再加入Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤3，盐洗，用包含1M～3MNaCl和0.4～0.6M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤2收集的油脂，再加入包含2M～3MNaCl和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤4，尿素清洗，用8M～10M尿素重悬步骤3收集的油脂，轻微摇晃让余下的蛋白充分变性，再加入Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤5，正己烷清洗，将步骤4收集的油脂层与包含质量浓度为0.003％～0.005％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的正己烷混合，震荡后经高速冷冻离心后收集包含油脂的正己烷相，用高纯氮气吹干正己烷；

步骤6，蔗糖梯度离心，用包含0.4～0.6M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤5吹干的油脂，再加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤7，蛋白电泳，将步骤6收集的油脂进行蛋白电泳；

步骤8，电泳洗脱，电泳结束后将目标条带切下并清洗干净，然后进行电泳洗脱即得到目的蛋白液。

2.根据权利要求1所述的提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，步骤1中，所述的植物蛋白酶抑制剂混合物由4-2-氨乙基苯磺酰氟盐酸盐、苯丁抑制剂、胃酶抑制剂A、E-64、亮抑酶肽和1,10-邻菲咯啉组成。

3.根据权利要求1所述的提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，所述的Hepes-KOH缓冲液的浓度为25mM，pH值为7.5。

4.根据权利要求1所述的提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，步骤1中，离心速度为10000g。

5.根据权利要求1所述的提取衣藻中脂蛋白的方法，其特征在于，步骤2～步骤6中，离心速度为100000g。