[发明专利]一种提取衣藻中脂蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程及微生物技术领域，具体涉及一种从衣藻的油脂中提取脂蛋白的方法。

背景技术

生物柴油是指以油料作物如大豆、油菜、棉、棕榈等，野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换或热化学工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。

海洋微藻可以在一定的生理条件下积累大量的油脂，其中主要是甘油三酯(TAG)，可作为一种可再生的生物能源，日益受到关注。已有研究发现，在缺少氮或硫等元素的培养条件下，莱茵衣藻能够快速的积累主要成分为甘油三酯的油脂。莱茵衣藻是一种单细胞真核微藻，目前它的全基因组测序已经完成，这使得它能够成为研究微藻油脂代谢途径的模式藻株。

脂蛋白是与脂质结合在一起形成的脂质-蛋白质复合物。脂蛋白中脂质与蛋白质之间没有共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组分之间以疏水性相互作用而结合在一起。

现有的油脂提取方法主要来自于E.G.Blight(CanadianJournalofBiochemistryandPhysiology1959,37:911-917.)和JordiFolch(J.Biol.Chem.1957,226:497-509.)的报道，主要利用氯仿和甲醇以及水形成分层和油脂在氯仿以及甲醇中溶解度不同进行萃取。此方法虽然快捷，但是毒性较大，且容易造成脂蛋白丢失。脂蛋白的相关研究可以为微藻中油脂合成相关蛋白提供更多有利的数据，然而相关脂蛋白的研究未见报道。

发明内容

针对现有技术中从微藻中提取油脂时毒性较大，脂蛋白易被破坏，无法提取出脂蛋白的缺陷，本发明提供了一种提取衣藻中脂蛋白的方法。

本发明的技术方案如下：一种提取衣藻中脂蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1，破碎处理，首先将营养胁迫处理、积累大量油脂的衣藻细胞溶液离心收集沉淀，然后加入包含蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物的Hepes-KOH缓冲液重悬细胞沉淀，之后将细胞破碎，匀浆中加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤2，活性剂清洗，用包含0.1％～0.2％的吐温-20和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤1收集的油脂，再加入Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤3，盐洗，用包含1M～3MNaCl和0.4～0.6M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤2收集的油脂，再加入包含2M～3MNaCl和0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤4，尿素清洗，用8M～10M尿素重悬步骤3收集的油脂，轻微摇晃让余下的蛋白充分变性，再加入Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤5，正己烷清洗，将步骤4收集的油脂层与包含质量浓度为0.003％～0.005％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的正己烷混合，震荡后经高速冷冻离心后收集包含油脂的正己烷相，用高纯氮气吹干正己烷；

步骤6，蔗糖梯度离心，用包含0.4M～0.6M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液重悬步骤5吹干的油脂，再加入包含0.2M～0.3M蔗糖的Hepes-KOH缓冲液，经高速冷冻离心后收集油脂层；

步骤7，蛋白电泳，将步骤6收集的油脂进行蛋白电泳；

步骤8，电泳洗脱，电泳结束后将目标条带切下并清洗干净，然后进行电泳洗脱即得到目的蛋白液。

步骤1中，所述的植物蛋白酶抑制剂混合物由4-2-氨乙基苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、苯丁抑制剂、胃酶抑制剂A、E-64、亮抑酶肽和1,10-邻菲咯啉组成。

所述的Hepes-KOH缓冲液的浓度为25mM，pH值为7.5。

步骤1中，离心速度为1000g。

步骤2～步骤6中，离心速度为50000g。

本发明克服常规有机溶剂萃取方法中的不足，通过蛋白物理性质和化学性质对杂蛋白进行去除，采用蔗糖梯度离心法不断洗脱杂蛋白最终得到油脂中的脂蛋白，保护油脂中的脂蛋白不受影响，为脂蛋白的相关研究及油脂代谢研究提供基础，在微藻油脂代谢研究中具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明的脂蛋白提取过程中各步骤收集的油脂的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1

1.营养胁迫处理莱茵衣藻