[发明专利]一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法。

背景技术

榕母管蓟马(Gynaikothripsficorum)与榕管蓟马(Gynaikothripsuzeli)均属于缨翅目(Thysanoptera)管蓟马科(Phlaeothripidae)母管蓟马属(Gynaikothrips)，是我国热带和亚热带地区榕树上的重要经济害虫。两种蓟马锉吸危害榕树新梢及嫩叶，初期导致叶片卷曲形成“饺子”状或“疙瘩”状虫瘿，整个虫体藏匿于其中栖息、生活与繁殖，后期叶片逐渐出现变硬及枯死症状，危害严重时会导致整株叶片变黄枯死脱落，特别是盆景榕树受害后，无论观赏价值还是经济价值都大大降低。此外，近年来，随着榕树苗木、盆景在不同地区间的调运，两种蓟马已经传播至我国东北的黑龙江、辽宁，西北的内蒙古及华北地区的河南、河北和山东地区的温室内及园林景区。综上所述，尽快找到一种快速准确鉴定这两个种的方法从而采用合理的方法对它们进行防治就显得尤为重要。然而，大量蓟马方面的分类专家发现，榕母管蓟马和榕管蓟马无论体型、体色还是其它鉴定特征方面都非常相似，即使是专业技术人员也常常将它们弄混淆。由于这两种蓟马个体较小并且非常相似，仅通过形态特征对这两个种进行鉴别非常困难。

随着DNA分子标记技术的发展和成熟，DNA条形码技术在物种鉴定中的应用越来越广泛，为我们提供了一种经济、简单、快捷并且准确的物种鉴定方法。DNA条形码技术在鸟类，鱼类中的应用已有大量的研究报道，然而在缨翅目昆虫中的报道相对较少，仅有关于田间蓟马种类鉴定的报道，而关于榕树上的主要害虫—管蓟马鉴定方面未见有报道。因此，本发明的目的是通过标准DNA条形码分子标记，实现榕母管蓟马和榕管蓟马快速准确鉴别。

发明内容

为了解决传统形态学很难准确鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的问题，本发明提供一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法。

发明人利用DNA条形码通用型引物对提取的榕母管蓟马和榕管蓟马线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrialcytochromecoxidasesubunitIgene,mtDNACOI)基因(646bp)或核糖体DNA第二内部转录间隔区(internaltranscribedspacer2,ITS2)分子标记进行PCR扩增及双向测序，并对序列进行拼接比对、数据处理，采用邻接法(NJ法)构建系统发育树，并以K2P(Kimuratwo-parameter)模型计算种内种间遗传距离，鉴别开了榕母管蓟马和榕管蓟马。

本发明提供的一种鉴别榕母管蓟马和榕管蓟马的分子方法，包括如下步骤：

1)提取待鉴定样品的总基因组DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，使用引物对进行PCR扩增，并纯化PCR扩增产物；

3)对步骤2)的纯化后的PCR扩增产物进行测序，依据特定位点的测序结果判断样品为榕母管蓟马还是榕管蓟马。

其中，所述引物对为COI基因引物对和/或ITS2分子标记引物对。

所述COI基因引物对如下：

上游引物：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

下游引物：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述ITS2分子标记引物对如下：

上游引物：5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；

下游引物：5'-ATCACTCGGCTCGTGGATCG-3'，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

当使用COI基因引物对时，依据扩增产物的第28、78、82、88、92、97、103、151、166、172、214、235、265、271、328、337、347、355、364、370、445、457、470、472、503、525、538、610、616、619、622bp处碱基进行判断：

如上述位点的碱基依次为G、C、G/T、A、A/T、C、G、T、G、C、G、T、A、C、G、A、T、T、A、A、A、C、G、C、G、T/G、G、A、A、G、T的则为榕母管蓟马；

如上述位点的碱基依次为A、T、G、G、A、T、A、C、A、T、A、C、G、T、A、G、C、C、G、G、A、T、A、T、T、T、A、G、G、A、C的则为榕管蓟马。