[发明专利]一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）挑取新活化的大肠杆菌单菌落至2mlLB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；

b）取500μl过夜培养物转接到50mlSOB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.4~0.6；

c）将菌液转移到预冷的无菌离心管中，加入5ml预冷的缓冲液I，混匀，冰浴10min；

d）于4℃以4000rpm离心5min收集细菌；

e）用2ml预冷的缓冲液II重悬细菌，冰浴10min后，100μl/管分装，-80℃保存，即得到大肠杆菌感受态细胞。

2.一种大肠杆菌感受态细胞的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）取一管权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞，冰上融化后加入相应量的质粒DNA，混匀；

2）于42℃热击90~120sec；

3）将菌液涂布于抗性平板上，37℃培养12~16h后菌落计数，计算转化效率。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述缓冲液I为包含以下成分的水溶液：0.5~1.5M氯化钙（CaCl₂），0.1~0.5M氯化锰（MnCl₂），0.1~0.5M甘氨酸，0.1~0.5%（v/v）去垢剂，pH值为4.0~6.0；其中所述去垢剂由以下试剂中的一种或几种组成：聚乙二醇辛基苯基醚（Tritonx-100）、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）或乙基苯基聚乙二醇（NP-40）。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述缓冲液II为包含以下成分的水溶液：50~150mM氯化钙（CaCl₂），10~50mM氯化锰（MnCl₂），10~50mM甘氨酸，0.5~2mM三磷酸腺苷（ATP），0.5~2mM二硫苏糖醇（DTT），20~100μg/ml核酸沉淀剂，5~15%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），pH值为4.5~6.5；其中所述核酸沉淀剂由以下试剂中的一种或几种组成：糖原（Glycogen）、酵母tRNA或鲑鱼精DNA。