[发明专利]一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法。

背景技术

大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA(PlasmidDNA，PhageDNA等)，处于这种状态的细胞称为“感受态细胞”(CompetentCell)。将外源DNA分子导入受体细胞，使之获得新的遗传性状的过程称为“转化”。在微生物学、分子生物学、基因工程等研究领域，经常要使用各种感受态细胞进行DNA的转化操作。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂法、Hanahan和Inoue法。CaCl₂法（CohenSN,ChangACY,HsuL.Nonchromosomalantibioticresistanceinbacteria:genetictransformationofEscherichiacolibyR-factorDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1972,69:2110-2114.）是目前实验室制备感受态细胞的常规方法，该方法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，只能满足常规分子生物学实验需求；Hanahan法（HanahanD.StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmid.J.Mol.Biol.1983,166:557-580.）对操作人员的技巧、细心程度和试剂纯度要求较高，可重复性低；Inoue法（InoueH.,HNojimaandOkayamaH.HighefficiencytransformationofEscherichiacoliwithplasmids.Gene.1990,96:23-28.）虽然感受态细胞的转化效率较高，但对细菌的OD₆₀₀值要求比较严格，并且培养温度是18℃，细菌在此温度下生长缓慢，培养时间较长（约20~50h），过程相对繁琐。

目前，感受态细胞的制备和转化过程十分繁琐，制备过程需要多次离心收集细胞、重悬细胞；转化过程中，热激反应前需要长时间冰浴，热激反应后需要加入培养基进行长时间培养复苏，大大降低了实验效率。此外，利用常规方法制备的感受态细胞，转化效率较低，不能满足特殊的生物学实验的要求（如DNA文库构建、大片段DNA的转化）。因此，研究一种转化效率高、操作简单快速、可重复性高的方法用于感受态细胞的制备和DNA转化，对分子生物学的研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于，简化大肠杆菌感受态细胞的制备和转化步骤，提高大肠杆菌的DNA转化效率，提供一种大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：

a）挑取新活化的大肠杆菌单菌落至2mlLB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；

b）取500μl过夜培养物转接到50mlSOB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.4~0.6；

c）将菌液转移到预冷的无菌离心管中，加入5ml预冷的缓冲液I，混匀，冰浴10min；

d）于4℃以4000rpm离心5min收集细菌；

e）用2ml预冷的缓冲液II重悬细菌，冰浴10min后，100μl/管分装，-80℃保存，即得到大肠杆菌感受态细胞。

一种大肠杆菌感受态细胞的转化方法，包括以下步骤：

1）取一管上述大肠杆菌感受态细胞，冰上融化后加入相应量的质粒DNA，混匀；

2）于42℃热击90~120sec；

3）将菌液涂布于抗性平板上，37℃培养12~16h后菌落计数，计算转化效率。

上述大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述缓冲液I为包含以下成分的水溶液：0.5~1.5M氯化钙，0.1~0.5M氯化锰，0.1~0.5M甘氨酸，0.1~0.5%（v/v）去垢剂，pH值为4.0~6.0；其中所述去垢剂由以下试剂中的一种或几种组成：聚乙二醇辛基苯基醚（Tritonx-100）、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）或乙基苯基聚乙二醇（NP-40）。