[发明专利]猪特异性友好位点Pifs102及其应用

权利要求书

1.特异性靶向猪特异性友好位点Pifs102的sgRNA，其特征在于，所述友好位点Pifs102在基因组上的位置为：第13号染色体上第98768519bp，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，2011年9月；

转录所述sgRNA的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.转录权利要求1所述sgRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

3.针对猪特异性友好位点Pifs102的CRISPR/Cas9打靶载体，其特征在于，所述友好位点Pifs102在基因组上的位置为：第13号染色体上第98768519bp，基于猪基因组序列信息版本号Sscrofa10.2，2011年9月；

CRISPR/Cas9打靶载体中sgRNA的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求3所述打靶载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将权利要求2所述DNA序列进行互补配对，形成双链DNA；

2)将px330骨架载体用限制性内切酶BbsⅠ进行酶切过夜，回收后，与步骤1)得到的双链DNA连接，即得。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述互补配对的反应程序为：94℃变性5min，35℃退火10min，0～4℃保存。

6.针对猪特异性友好位点Pifs102的同源重组载体，其特征在于，所述友好位点Pifs102在基因组上的位置为：第13号染色体上第98768519bp，所述载体含有两端带有Pifs102位点同源左臂和同源右臂的外源目的基因；

所述同源左臂以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列作为引物，以基因组DNA为模板扩增得到；

所述同源右臂以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列作为引物，以基因组DNA为模板扩增得到。

7.权利要求6所述同源重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以猪细胞基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示引物序列扩增Pifs102位点的同源右臂，利用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物序列扩增Pifs102位点的同源左臂；

2)将外源目的基因通过NheI和NotI限制性内切酶连入同源重组载体。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述外源目的基因的两端带有loxP序列，一端为突变型loxP，序列如SEQ ID No.7所示，另一端为野生型loxP。

9.一种转基因方法，其特征在于，将权利要求3所述的打靶载体与权利要求6所述的同源重组载体按物质的量1:1的比例混合，用电击转染或脂质体转染的方法共转入猪成纤维细胞。