[发明专利]三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及代谢组学的技术领域，具体说是一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前 处理及样本检测方法。

背景技术

随着人类基因组测序工作完成，基因功能的研究成为热点，各种“组学”相继出现， 代谢组学继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后应运而生。代谢物组学的研究对象是生 物体内整体代谢物的变化，为了更加全面、系统地了解这种变化，代谢物分析方法应依据代 谢物物理化学参数的差异，采用不同的分析方法，力求满足高选择性、高灵敏度、高通量、多 维、动态、多参量的特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样 本检测方法。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:

本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理方法，包括以下步骤：

（1）培养三孢布拉氏霉菌：

a、种子培养：将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量 100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；

种子培养基按质量百分比组包括：玉米淀粉3.5%、黄豆饼粉2.3%、KH2PO40.15%、 MgSO4?7H2O0.01%、工业玉米浆1%、豆油0.5%，其余为水；

b、发酵培养：将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向 发酵过程中流加混菌发酵液；

发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉2.0%、KH₂PO₄0.25%、MgSO₄? 7H₂O0.02%、豆油3.0%、工业玉米浆2.0%、维生素B10.005%、柠檬酸三钠0.3%、曲拉通 0.1%、BHT0.05%、混菌发酵液10%，其余为水；

（2）样品制备：

分别取12h、48h、72h的样品进行代谢样品制备；

A：利用不同提取液对相同样品进行提取，提取剂为：-40℃预冷的60%v/v乙醇水、2: 2:1v/v的氯仿：乙醇：水、60%v/v沸乙醇、60%v/v冷甲醇；

B:样品衍生化

取200μL提取液加10μL的1mg/mLγ-氨基丁酸，真空冷冻干燥后，加50μL浓度为20mg/mL的甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液，充分溶解样品，置于40°C水浴中，反应80min；

加80μLN-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺，混合均匀，置于40°C水浴中，反应80min；

将衍生后的样品10000r/min离心5min；取上清液100μL加入进样瓶中，并编号，于室温放置2h。

本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组样品的检测方法，对样品进行GC-MS检测；

GC条件：AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样口温度：280°C；升温程序：初 始温度70°C保持2min，以5°C/min程序升温至290°C保持5min；载气：高纯氦气，恒压模式 91kPa；进样量1μL；柱后分流比10:1；

MS条件：接口温度：280°C；电离方式：EI；电离方式：电子轰击电离（EI+）；离子源温度： 250°C；电子轰击能量：70eV；电子电流：40μA；扫描质量范围：50-800m/z。

本发明具有的优点和积极效果是:

本发明的三孢布拉氏霉菌代谢组的样品前处理及样本检测方法中，利用PDA培养基培 养三孢布拉氏霉菌，培养4d后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用；冷冻研磨破碎菌 丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活；真空冷冻干燥后，经过肟化或 腙化、硅烷化两步衍生化反应后用于GC-MS检测。本发明还提供了利用GC-MS对上述样品 的检测方法，检测条件如下：选用AgilentHP530m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；进样量1μL ；程序升温；离子源温度250℃，全扫描范围m/z50～800。采用本发明能得到重现性较好 的代谢组检测结果。

附图说明

图1是采用-40℃预冷的60%v/v乙醇水作为提取剂时的GC-MSTIC总离子流图；

图2是采用2:2:1v/v的氯仿：乙醇：水溶液作为提取剂时的GC-MSTIC总离子流图；